新生小鼠海馬神經元培養及形態學觀察的優化方法＊

常 翔，方淑環，張 玉，閆 蓉，屈 趙，侯雪芹，蘇如玉，張 磊，楊 從，王 奇

（廣州中醫藥大學臨床藥理研究所，廣州510405）

海馬在認知、學習和記憶等方面都扮演著極為重要的角色［1］，是阿爾茨海默?。ˋlzhei mer′s disease，AD）的主要病變部位，利用海馬神經元建立一個直觀的體外研究的神經元活動的實驗模型，對阿爾茨海默病等神經性疾病的研究有著極大的價值。關于神經突觸的研究方面，樹突棘的形態學觀察具有很重要的價值，綠色熒光蛋白（green fluorescent protein，GFP）對神經元進行轉染后能夠清晰觀察到單個神經元軸突、樹突、樹突棘等，但這一方法對神經元狀態及轉染效率的控制要求較高，而一般胎鼠海馬神經元培養以及利用脂質體介導的轉染較難達到這一要求。本文在文獻基礎上［2-7］進行改進優化，培養出具有良好形態的小鼠海馬神經元，并用適當方法轉染，得到單個神經元和樹突棘形態特征清晰的顯像，為神經突觸研究提供基礎，現將方法報道如下。

1 材料與方法

1．1 材料 新生小鼠（P0），由廣州中醫藥大學實驗動物中心提供；DMEM、F12、B27、HBSS、FBS、Neurobasal medium培養基、丙酮酸鈉等均購自Gibico公司，多聚賴氨酸、DNAse購自Sig ma公司，24孔培養板（COSMO）由廣州友田生物科技有限公司提供。

1．2 原代細胞培養

1．2．1 培養板的處理 24孔板中每孔加入30μg／mL的多聚賴氨350μL，37℃培養箱中過夜，滅菌水洗3次，晾干，封口膠封邊，4℃保存。使用前于每孔中加入500μL的DMEM潤洗，放入37℃培養箱中備用。

1．2．2 試劑配制 解剖液成分：HBSS 49 mL，1 M葡萄糖500μL，雙抗（青霉素／鏈霉素）500μL，置于冰上備用。消化液成分：HBSS 2．5 mL，0．25%胰酶2．5 mL。重懸液成分：F12 2．5 mL，DMEM 2．5 mL，雙抗2．5 mL，DNAse 5μL。培養液成分：神經干細胞培養基47．5 mL，丙酮酸鈉500μL，雙抗500 μL，L-谷氨酰胺500μL，B27 1 mL。消化液及培養液放入37℃水浴箱中預熱。

1．2．3 培養方法 用70%乙醇消毒超凈臺及使用器械，超凈臺上鋪手術巾，打開紫外燈照射40 min。打開解剖顯微鏡，取1個60 mm培養皿倒入解剖液，置于解剖顯微鏡下。取新生小鼠（P0）置于手術巾上，70%乙醇消毒，斷頭處死，剪開頭皮及顱骨，取出全腦，放入解剖液中，于解剖顯微鏡下剔除腦膜和血管，剝離出海馬組織，移入裝有解剖液的15 mL離心管中置于冰上。以上解剖應在1 h內完成。用冰解剖液將海馬洗3次，棄去解剖液，加入0．125%的低濃度胰酶于37℃水浴箱中消化20 min，其間每隔4～5 min充分晃動離心管以促進消化。消化結束后加入10%體積分數的胎牛血清終止消化。以2 000 r／min離心5 min后棄上清液，加入重懸液重懸細胞，用火焰拋光的巴斯德滴管吹打數次，充分分離神經元，用細胞篩過濾細胞至一新的離心管中，加入10%體積分數的胎牛血清后以2 000 r／min離心5 min，棄去上清液，加入培養液重懸細胞，充分吹打混勻，進行細胞計數，以每孔8×104個細胞接種于24孔板中，置于37℃細胞培養箱中培養。每隔3～4 d更換1／4培養基。選取不同時間點在倒置顯微鏡下觀察并拍照。

1．3 GFP轉染 GFP在細胞和分子生物學中通常被用來作為一個報告基團［8］，在藍光照射下可以發出明亮的綠色熒光。培養至第17天的細胞采用磷酸鈣共沉淀法［9］，配制CaCl2-DNA-磷酸緩沖液的復合物，進行GFP質粒DNA的轉染，轉染48 h后固定細胞，于熒光顯微鏡下進行形態學觀察。

2 結 果

在倒置顯微鏡下觀察，細胞接種后為透亮圓形較小的細胞，12 h后完全貼壁，長出短小的突起；3～4 d后突起逐漸增長增多，形成稀疏的網絡，此時神經元胞體多為橢圓形或三角形；5～7 d神經元胞體逐漸增大，突起增粗，細胞間形成網絡，細胞體核突起明顯，立體感增強（圖1）。第17天進行GFP轉染，48 h后固定細胞于熒光顯微鏡下觀察，胞體進一步增大，呈橢圓形，可以清楚觀察到從胞體伸出的軸突和多條樹突，樹突棘明顯（圖2～4），為典型的海馬神經元的結構特征。

圖1 培養7 d的海馬神經元細胞（普通光學顯微鏡×400）

圖2 培養17 d轉染GFP后的神經元細胞（熒光顯微鏡×400）

圖3 培養17 d的海馬神經元樹突及樹突棘明顯增多（熒光顯微鏡×600）

圖4 轉染GFP后的樹突及樹突棘（熒光顯微鏡×600）

3 討 論

在阿爾茨海默病的研究中，神經元是研究的重要物質基礎，神經突觸是研究的重要方面。海馬是神經元比較集中的組織，非神經元細胞在此處較少，故在進行神經元的原代培養時首選海馬組織。傳統方法多用胎鼠進行原代海馬神經元的培養，但是胎鼠的胎齡不易掌握，海馬剝離困難，且某些核團和功能區的解剖部位不易準確定位［10］，而新生小鼠的海馬易于剝離，且神經元分化程度較高，神經突起發育成熟，故新生鼠是更好的選擇［11-12］。另外，在進行神經突觸研究時，樹突棘的形態學觀察和計數是一個重要方面，因此，對于單個神經元的清晰顯像就顯得尤為重要，本實驗所應用的磷酸鈣共沉淀法轉染GFP不失為一種理想的選擇。

在海馬神經元的培養中，對于實驗條件的要求較為苛刻，因此，在實驗中要尤其注意取材及組織消化過程、培養基成分、細胞接種數量等問題。首先，新生小鼠的海馬外包裹有一層血管膜，在取材過程中一定要注意將這層血管膜清除干凈，否則血管膜的一部分成纖維細胞會混入原代培養中，這些細胞會大量分裂，導致實驗失敗。其次，新生小鼠的神經元之間以及神經元與纖維組織之間結合比較緊密，消化分離的過程容易造成損傷，因此，消化分離過程中一般使用0．125%的低濃度胰酶，其間動作要輕柔，消化時間不宜過長，控制在20 min內，并輕柔均勻振搖分散組織，盡可能減少消化分離過程中造成的機械和化學損傷。第三，在神經元的培養中，培養基是實驗成功的關鍵因素之一，在本實驗中使用B27代替血清配置無血清培養基，相對于血清而言，B27成分清楚，含有多種細胞生長的必要因子，是較為理想的添加劑。采用B27無血清培養基可以選擇性地使神經元生長，而抑制非神經元細胞的生長和增殖［13］，能夠起到純化神經元的作用。此外，該培養基含有多種抗氧化劑，能夠保持神經元的活性［14］。最后，種板密度也是實驗中重要一環，在神經突觸研究中對樹突棘的形態學觀察常需要以單個神經元作為觀察對象，故種板密度不宜過高，當然，種板密度過低，神經元不能相互接觸，也會導致神經元難以存活或者成熟。因此，通常需要在預實驗中接種不同密度細胞觀察獲得合適的細胞密度。另外，在本實驗中未應用阿糖胞苷等抑制細胞有絲分裂的藥物來抑制膠質細胞的生長，因阿糖胞苷的用量較難控制，劑量過小則不能起到抑制膠質細胞增殖的作用，而劑量過大會對神經元產生毒性作用，影響神經元活性［15］。

在本實驗中應用的GFP是一種不需要任何外源反應底物，只需要藍光照射就可以發出熒光的一種蛋白，常被用來進行活細胞標記。由于GFP對神經元僅有極小的毒性作用，因此，在神經生物學研究中常被用來作為報告基團［16］。本實驗用e GFP質粒轉染培養17～19 d的小鼠海馬神經元細胞，采用了傳統的磷酸鈣共沉淀法進行轉染，相較于常用的脂質體介導的轉染，前者更適合于做神經元細胞爬片的轉染［7］，并且磷酸鈣共沉淀法轉染效率較低，對于以單個神經元為觀察對象的神經突觸的形態學方面的研究，該方法顯得更為優越。本實驗中，轉染48 h后在熒光顯微鏡下進行形態學觀察，結果顯示神經元胞體飽滿、細胞突起豐富，神經元細胞處于最佳狀態，軸突、樹突及樹突棘顯像清晰。磷酸鈣共沉淀法對小鼠海馬神經元進行GFP轉染效果良好。

綜上所述，在阿爾茨海默病的研究中，選用最優化的方法培養海馬神經元細胞是研究的基礎，而用GFP標記單個神經元在神經突觸的形態學［9］及電生理［17］等研究中都極為重要。本文中所采用的神經元培養方法及GFP轉染方法具有極大優越性，可進行推廣使用。

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