結直腸癌患者K-ras基因突變的表達及臨床意義研究＊

周 政，陳大鵬

（1．重慶三峽中心醫院檢驗科，重慶萬州404000；2．重慶醫科大學附屬兒童醫院檢驗科，重慶400014）

隨著人們的行為方式、飲食結構及自然環境的改變，結直腸癌發病率呈明顯上升趨勢。盡管作用機制仍未完全清楚，但多數研究認為K-ras基因突變是結直腸癌發生的早期事件，在結腸腺瘤癌變過程中發揮重要作用。西方人種結、直腸癌原發灶組織的K-ras基因突變率為30%～60%［1］，而東方人種則為17%～28%［2］。西妥昔單抗競爭性阻斷表皮生長因子受體（EGFR）和其他配體，從而抑制癌細胞的增殖，誘導癌細胞的凋亡，療效比較明確。但研究表明K-ras基因突變可以導致對西妥昔單抗原發性耐藥，檢測K-ras基因點突變是保證分子靶向治療有效的關鍵。

1 資料與方法

1．1 一般資料 2010年1～11月，隨機選擇本院初診的212例結直腸癌患者。其中，男144例，女68例。按年齡分組：19～44歲，70例；45～59歲，52例；大于60歲，90例。按腫瘤部位分組：大腸彌散分布4例，直腸腫瘤108例，結腸腫瘤100例；按腫瘤分化程度分組：低分化腫瘤60例，中分化腫瘤144例，高分化腫瘤8例；按Dukes病理診斷分期分組：A期48例，B期72例，C期72例，D期20例。其中淋巴結轉移84例。所有患者的臨床診斷均由病理組織活檢、臨床表現、實驗室檢查確診。按照2∶1的比例設對照，健康對照組由106名健康體檢人員組成。

1．2 方法

1．2．1 標本處理 取受試者外周血3～5 mL乙二胺四乙酸（EDTA）抗凝，3 000 r／min離心15 min分離血漿，-80℃冷凍保存。用Hep G2細胞作為陽性對照（Hep G2細胞DNA穩定地含有K-ras 12密碼子突變的SW480 DNA）。

1．2．2 DNA提取 采用Qiagen試劑提取血漿游離DNA。紫外分光光度儀測定DNA含量，應用3～5 mL外周血可獲得約10μg游離DNA。

1．2．3 擴增 （1）檢測基因組DNA看家基因globin：引物Globin-R：ATC AAG CGT CCC ATA GAC TCA C，Globin-F：GAT CTG TCC ACT CCT GAT GCT G，PCR產物196 bp。擴增條件：94℃3 min，然后依次94℃30 s、59℃30 s、72℃30 s，共35次循環，最后72℃10 min。反應結束后，取10μL產物進行20 g／L瓊脂糖凝膠電泳，利用凝膠成像儀觀察結果。（2）RE-PCR［3-4］：第1輪PCR體 系：1．5μmol／L Mg Cl2，1×PCR buffer，0．5 U Hot-Start Taq，200μmol／L d NTP，0．1 μmol／L pri mers［L-Ext（5′GCT CTT CGT GGT GTG GTG TCC ATA TAA ACT TGT GGT AGT TGG ACC T 3′），RExt（5′GCT CTT CGT GGT GTG GTG TCC CGT CCA CAA AAT GAT TCT GA 3′）］。擴增條件：95℃15 min，94℃30 s、52℃30 s，20次循環，72℃5 min 1次循環。擴增產物用Bst NI消化。1／20的消化產物進行第2輪Hot-Start PCR：1 μmol／L引物L-Bst（5′ACT GAA TAT AAA CTT GTG GTA GTT GGA CCT 3′），R-Bst（5′GTC CAC AAA ATG ATC CTG GAT TAG C 3′）。擴增條件：95℃15 min，94℃30 s、56℃30 s，40次循環，72℃5 min 1次循環。87 bp的擴增產物用Bst NI消化后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳。K-ras陽性認定標準：終產物出現71 bp大小的片段。K-ras突變最終經DNA測序確定。

1．2．4 主要試劑及儀器 DNA提取試劑盒（組織DNA和血漿游離DNA）購自德國Qiagen公司；Premix Taq、Hot-Start Taq、Bst NI購自德國Qiagen公司；引物由上海英駿生物技術有限公司合成。紫外分光光度儀、PCR擴增儀、電泳儀及凝膠成像儀為美國BIO-RAD公司產品。

1．3 統計學處理 采用SPSS17．0軟件進行分析處理，分類資料統計分析采用χ2檢驗，以P＜0．05為差異有統計學意義。

2 結 果

2．1 血漿游離DNA提取結果 以看家基因globin擴增產物電泳作為血漿游離DNA提取物的鑒定結果。212例初診患者標本中，血漿游離DNA均提取成功。106例健康對照組中均無血漿游離DNA提出（圖1）。腫瘤中心組織均提取出DNA。

圖1 血漿游離DNA PCR產物瓊脂糖凝膠電泳圖

圖2 K-ras野生型檢測圖譜

2．2 腫瘤中心病理組織K-ras突變檢測結果 212例患者中發生K-ras突變（12密碼子）的有33例（15．57%，33／212）。本研究共發現2個突變類型，12位密碼子由GGT突變為GAT（圖2、3）；12位密碼子由GGT突變為GTT（圖2、3）。

圖3 K-ras突變型檢測圖譜

表1 血漿游離DNA K-ras突變檢測結果及與 病理組織、臨床特征的關系

2．3 血漿游離DNA K-ras突變檢測結果及與病理組織、臨床特征的關系 212例患者同時進行活檢標本和血漿游離DNA K-ras。檢測結果34例患者血漿游離K-ras突變陽性（16．04%），33例患者病理活檢標本陽性（15．57%），二者比較差異無統計學意義（χ2＝2．31，P＝0．31）。其中，1例患者腫瘤呈大腸彌散分布，2次病理組織活檢結果均為陰性，而其血漿游離DNA分析結果為陽性，經多次活檢后確定為黏液腺癌。K-ras基因突變與腫瘤的部位（結腸、直腸、彌散分布）無明顯關系（χ2＝3．34，P＝0．61）；與結直腸癌分化程度（高、中、低）無明顯關系（χ2＝2．38，P＝0．29）；與結直腸癌病理分期（Dukes分期）無明顯關系（χ2＝2．84，P＝0．38）；與結直腸癌有無淋巴結轉移無明顯關系（χ2＝0．98，P＝0．37）；與結直腸癌患者年齡無明顯關系（χ2＝1．86，P＝0．39）。見表1。

3 討 論

腫瘤細胞持續釋放DNA入血，導致外周血DNA增高且存在與原發腫瘤組織一致的分子生物學改變［5］。本研究結果顯示腫瘤患者血液中確實存在健康人群不存在或是不能被檢出的游離DNA。血漿游離DNA的檢出量也與疾病進程相關。本研究在初診患者中均檢測到血漿游離DNA，而在疾病緩解期的患者中則未檢出。在病情逐漸好轉的情況下，患者血漿中的游離DNA濃度逐漸減低。因此，檢測血漿游離DNA有助于腫瘤患者疾病進展情況的評估以及預后判斷。

ras基因產物參與控制基因轉錄的激酶信號傳導路徑，因而能調節細胞的生長與分化。ras蛋白隨ras基因的改變而發生變化，其結果是發生改變的ras蛋白不再具有裂解和釋放GTP分子的能力，這種改變導致該信號傳導路徑始終處于“開通”的狀態，從而導致細胞的生長和增生。ras過度表達導致持續的細胞增殖，這是腫瘤發生的關鍵一步，同時涉及多種腫瘤的發生，其中最常見的是結直腸腫瘤。結直腸腫瘤的治療，外科手術是長期已確定的治療方案，而新興的腫瘤分子靶向治療是一種全新的生物治療模式［6-7］。K-ras基因是公認的癌基因，參與EGFR信號傳導過程。基因突變患者抗EGFR治療預后較差，導致不良反應，增加治療費用；野生型患者就很可能從抗EGFR藥物治療中獲益。因此，《美國國立癌癥綜合網絡（NCCN）結直腸癌臨床實踐指南》（2008年第3版）明確提出檢測K-ras基因。西妥昔單抗阻斷K-ras蛋白的表達，將凋亡信號傳遞到胞核內，抑制細胞增殖，促進細胞凋亡。患者對西妥昔單抗原耐藥可能與K-ras基因突變有關［8］，指導分子靶向治療的關鍵即是檢測K-ras基因點突變的存在與否。針對K-ras基因點突變的檢測，該研究發現血漿游離DNA與病理活檢標本具有相同的陽性率、一致性和臨床意義。其中1例患者初次病理活檢未查出K-ras基因突變陽性，而其相應的血漿游離DNA查出K-ras基因突變陽性，患者經再次活檢后檢測出K-ras基因突變陽性。分析其原因：該例患者病變呈大腸彌散分布，造成了取材的困難。因此，在未獲得病理證據時，血漿游離DNA的檢測能夠提供重要參考價值，為臨床的早期診斷、輔助診斷提供幫助，同時也為患者的個體化治療提供指導性的依據。全身各器官均可釋放DNA入血，檢測血漿游離DNA能夠反映與體內腫瘤相關的異常基因，是腫瘤基因診斷的一種新方法。

本研究結果顯示K-ras基因突變（12密碼子）突變率為15．57%，12密碼子突變有2種突變方式（12密碼子由GGT突變為GAT；12密碼子由GGT突變為GTT），與文獻報道一致［9］。K-ras基因突變與患者年齡、Dukes分期、分化程度、腫瘤部位、有無淋巴結轉移無明顯相關性［10-13］。但也有文獻［14］報道Dukes C期發生K-ras突變頻率最高，結腸腫瘤發生突變頻率比直腸高。

腫瘤組織與血漿K-ras基因突變率比較差異無統計學意義（P＞0．05），血漿克服了組織標本取材困難的弊端。通過血漿游離DNA檢測K-ras基因突變，方便、無創、快捷，能更好地應用于分子靶向藥物的選擇和臨床綜合治療。

［1］Elbjeirami WM，Sughayer MA．K-RAS mutations andsubtyping in colorectal cancer in Jordanian patients［J］．Oncol Lett，2012，4（4）：705-710．

［2］高楓，唐衛中，李衛．中國人散發性大腸癌K-ras基因突變的研究［J］．中華實驗外科雜志，2010，22（1）：65-67．

［3］Su YH，Wang M，Brenner DE，et al．Human urine contains small，150 to 250 nucleotide-sized，soluble DNA de-rived from the circulation and may be useful in the detection of colorectal cancer［J］．J Mol Diagn，2004，6（2）：101-107．

［4］Su YH，Wang M，Block TM，et al．Transrenal DNA as adiagnostic tool：important technical notes［J］．Ann NYAcad Sci，2004，1022：81-89．

［5］Leon SA，Shapiro B，Sklaroff DM，et al．Free DNA in theserum of cancer patients and the effect of therapy［J］．Cancer Res，1977，37（3）：646-650．

［6］Fleischhacker M，Schmidt B．Circulating nucleic acids（CNAs）and cancer-a survey［J］．Biochim Biophys Acta，2007，1775（1）：181-232．

［7］Zavodna K，Konecny M，Krivulcik T，et al．Genetiec analysis of K-ras mutation status in metastatic ceolorectalcancer patienis［J］．Neoplasma，2009，56（3）：275-278．

［8］吳軍．結腸癌K-ras突變與對西妥昔單抗耐藥的實驗研究［J］．外科理論與實踐，2009，14（4）：396-402．

［9］Bai YQ，Liu XJ，Wang Y，et al．Correlation analysis be-tween abundance of K-ras mutation in plasma free DNAand its correlation with clinical outcome and prognosis inpatients with metastatic colorectal cancer［J］．ZhonghuaZhong Liu Za Zhi，2013，35（9）：666-671．

［10］Rossi L，Veltri E，Zullo A，et al．Metastatic colorectalcancer first-line treatment with bevacizumab：the impactof K-ras mutation［J］．Onco Targets Ther，2013，6：1761-1769．

［11］Murray S，Karavasilis V，Bobos M，et al．Molecular predictors of response to tyrosine kinase inhibitors in patients with Non-Small-Cell Lung Cancer［J］．J Exp ClinCancer Res，2012，31：77．

［12］Sameer AS．Colorectal cancer：molecular mutations andpolymorphisms［J］．Front Oncol，2013，3：114［PMID：23717813 DOI：10．3389／fonc．2013．00114］．

［13］Klatz，Niemeyer M，Zenker M．An unexpected new roleof mutant ras：Perturbation of human embryonic development［J］．J Mol Med，2007，85（3）：227-235．

［14］Deschoolmeester V，Boeckx C，Baay M，et al．K-RAS mutation detection and prognostic potential in sporadic colorectal cancer using high-resolution melting analysis［J］．BrJ Cancer，2010，103（10）：1627-1636．