普魯蘭酶的分離純化及部分酶學性質

周念波

（武漢生物工程學院生物工程系，湖北武漢430415）

普魯蘭酶的分離純化及部分酶學性質

周念波*

（武漢生物工程學院生物工程系，湖北武漢430415）

對鹽球菌（Halococcus sp.）Z1、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）所產的普魯蘭酶粗酶液的耐熱耐酸性進行了比較研究，并采用（NH4）2SO4鹽析、透析、DEAE-Sephadex A25陰離子交換、Sephadex G-100凝膠過濾對Halococcus sp.Z1所產普魯蘭酶進行分離純化，并測定了其部分酶學性質。結果表明Halococcus sp.Z1所產普魯蘭酶在低于65℃和pH4.0～7.5范圍內有很好的穩定性，最適反應溫度為60℃，最適反應pH為5.0～5.4，相對分子質量為8.17×104，Km值為0.24 mg/mL。

普魯蘭酶；純化；性質

普魯蘭酶（Pullulanase，EC 3.2.1.41）是能夠專一性地作用于普魯蘭糖、支鏈淀粉、糖原及相應低聚糖中的α-1，6-糖苷鍵，從而切下整個側枝的一種脫支酶，已廣泛應用于以淀粉為原料的各種工業生產中。

文獻報道過的普魯蘭酶有多種，在應用方面近年來主要以開發耐熱耐酸普魯蘭酶為主。本試驗以實驗室篩選所得的鹽球菌（Halococcus sp.）Z1、解淀粉芽孢桿菌（Bacillus amyloliquefaciens）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）的發酵粗酶液為研究對象，探討其在熱穩定性和酸堿穩定性方面的性質，對其中符合耐熱耐酸特性的普魯蘭酶，進一步進行分離純化和其他方面酶學性質的研究。

1 材料與方法

1.1 試劑

普魯蘭糖，純度99%，上海普奧生物科技有限公司；DEAE-Sephadex A25，上海楷洋生物技術有限公司；Sephadex G-100，南京都萊生物技術有限公司；低分子量標準蛋白質，相對分子量1.44×104～9.74×104，大連寶生物工程有限公司。

1.2 菌種及培養基

鹽球菌（Halococcus sp.）Z1、解淀粉芽孢桿菌（Bacillusamyloliquefaciens）和枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），武漢生物工程學院酶工程實驗室自篩。

產酶發酵培養基：每100 g培養基中添加糯米淀粉2.5 g，蛋白胨1 g，（NH4）2SO40.25 g，MgSO4· 7H2O 0.05 g，FeSO40.001 g，KH2PO40.1 g，pH5.0。

搖瓶產酶條件：35℃，160 r/min，搖瓶培養48 h。

1.3 方法

1.3.1 粗酶液制備

搖瓶培養后，收集發酵液，5 000 r/min低溫離心后取上清液，制得粗酶液。

1.3.2 蛋白質濃度測定

蛋白質濃度測定采用Folin-酚試劑法（Lowry法）。

1.3.3 酶活測定

酶活測定參照參考文獻[7]。

1.3.4 硫酸銨分級沉淀

向粗酶液中緩慢加入（NH4）2SO4至25%飽和度，4℃靜置過夜后7 500 r/min冷凍離心，棄去沉淀。在清液中繼續加入（NH4）2SO4，使其飽和度達到75%，4℃靜置過夜后7 500 r/min冷凍離心，將沉淀溶于0.02 mol/L pH7.0的磷酸鹽緩沖液，置于透析袋中，用0.02 mol/L pH7.0的磷酸鹽緩沖液透析24 h。

1.3.5 DEAE-SephadexA25離子交換層析

將透析后的酶液上樣至已平衡好的層析柱（2 cm×15 cm），用0.02 mol/L pH7.0的磷酸鹽緩沖液（內含0.0 mol/L～0.5 mol/L的NaCl）進行梯度洗脫，控制流速為0.5 mL/min，每管5.0 mL收集，測定酶活，合并酶活較高的部分，用PEG20000進行濃縮。

1.3.6 SephadexG-100凝膠過濾層析

上步濃縮后的酶液上樣至已用0.02 mol/L pH7.0的磷酸鹽緩沖液平衡的層析柱（1.5 cm×50 cm），用相同緩沖液進行洗脫，控制流速為0.2 mL/min，每3.0 mL收集一管，測定各管酶活，合并酶活較高的部分，用PEG20000進行濃縮。

1.3.7 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳

采用不連續垂直平板電泳系統，對純化后的普魯蘭酶進行SDS-PAGE純度分析。濃縮膠和分離膠質量濃度分別為3%和15%，考馬斯亮藍R-250染色。

2 結果與分析

2.1 溫度對普魯蘭酶活性及穩定性的影響

分別于不同溫度下測定普魯蘭酶活力，以活力最高者為100%對照，試驗溫度對3種菌株所產普魯蘭酶活力的影響，結果見圖1。由圖1可知，菌株Halococcus sp.Z1所產酶在低于60℃范圍內，酶活隨溫度升高而升高，當溫度超過60℃后，酶活逐漸下降；菌株Bacillus amyloliquefaciens所產酶在60℃～70℃范圍內酶活較高，65℃時酶活最高；菌株Bacillus subtilis所產酶在50℃時酶活最高。因此菌株Halococcus sp.Z1、Bacillus amyloliquefaciens和Bacillus subtilis所產普魯蘭酶的最適作用溫度分別為60℃、65℃和50℃。

圖1 溫度對普魯蘭酶活力的影響

將普魯蘭酶液分別在不同溫度下保溫60 min后，再按1.3.3的方法測定殘余酶活，以活力最高者為100%對照，試驗溫度對3種菌株所產普魯蘭酶穩定性的影響，結果見圖2。由圖2可知，菌株Halococcus sp.Z1所產普魯蘭酶在低于65℃時穩定性較好，殘余活力在76%以上，溫度高于65℃后，酶活開始迅速下降；菌株Bacillus amyloliquefaciens所產酶熱穩定性范圍為低于70℃，殘余活力在80%以上；而菌株Bacillus subtilis所產酶的熱穩定性較前兩者稍差，殘余活力在80%以上的溫度范圍為低于55℃。

圖2 溫度對普魯蘭酶穩定性的影響

2.2 pH對普魯蘭酶活性及穩定性的影響

分別于不同的pH值下測定普魯蘭酶活力，以活力最高者為100%對照，試驗pH對3種菌株所產普魯蘭酶活力的影響，結果見圖3。由圖3可知，pH對3種菌株所產酶的活性均有較大的影響。菌株Halococcus sp.Z1所產普魯蘭酶在pH5.0～5.4范圍內對底物普魯蘭糖分解能力最強，酶活性最高；菌株Bacillus amyloliquefaciens所產酶在pH7.0～8.0范圍內對底物的分解能力最強，而菌株Bacillus subtilis在pH5.4時酶活性最高。因此，菌株Halococcus sp.Z1、Bacillus amyloliquefaciens和Bacillus subtilis所產普魯蘭酶的最適作用pH分別為5.0～5.4、7.0～8.0和5.4。

圖3 pH對普魯蘭酶活力的影響

將普魯蘭酶液在不同pH值緩沖液中于室溫保持24 h后，再按1.3.3的方法測定殘余酶活，以活力最高者為100%對照，試驗pH對3種菌株所產普魯蘭酶穩定性的影響，結果見圖4。由圖4可知，菌株Halococcus sp.Z1所產普魯蘭酶在pH4.0～7.5范圍內表現出較高的穩定性，殘余酶活力在88%以上，超出此pH范圍后酶的穩定性下降；菌株Bacillus amyloliquefaciens所產酶在pH6.0～8.0范圍內穩定性較高，殘余活力在90%以上；而菌株Bacillus subtilis所產酶的較高穩定性表現在pH4.4～7.5范圍內，殘余酶活力在86%以上。

圖4 pH對普魯蘭酶穩定性的影響

2.3 耐熱耐酸普魯蘭酶的確定

菌株Halococcus sp.Z1、Bacillus amyloliquefaciens和Bacillus subtilis所產普魯蘭酶的最適作用溫度、最適作用pH及熱穩定性和酸堿穩定性范圍見表1。

表1 3種菌株所產普魯蘭酶的最適作用溫度、pH及穩定性范圍

從表1可以看出，菌株Halococcus sp.Z1和Bacillus amyloliquefaciens所產普魯蘭酶具有較高的最適作用溫度和熱穩定性，符合耐熱的特性；菌株Halococcus sp.Z1和Bacillus subtilis所產普魯蘭酶的最適作用pH在pH5.0～5.4和pH5.4，酸堿穩定性分別在pH4.0～7.5和pH4.4～7.5范圍內，具有耐酸的特性。綜合考慮，菌株Halococcus sp.Z1所產普魯蘭酶既具有耐熱又具有耐酸的特性，因此以菌株Halococcus sp.Z1所產普魯蘭酶作為后續試驗樣品。

2.4 普魯蘭酶的純化

普魯蘭酶經鹽析、透析、離子交換和凝膠過濾后，結果見表2。經純化后，普魯蘭酶的純化倍數為10.78倍，酶活力回收率為26.91%。DEAESephadex A25離子交換層析和Sephadex G-100凝膠過濾層析的洗脫曲線分別見圖5和圖6。

2.5 普魯蘭酶純度鑒定和分子量測定

將純化后的普魯蘭酶及標準分子量蛋白進行SDS-PAGE，電泳結果見圖7。純化后的普魯蘭酶經SDS-PAGE后只有一條蛋白質譜帶，說明該酶達到了均一的程度。測得該普魯蘭酶的相對分子質量約為81 700。

表2 普魯蘭酶的純化結果

圖5 普魯蘭酶的DEAE-Sephadex A25柱洗脫曲線

圖6 普魯蘭酶的Sephadex G-100柱洗脫曲線

圖7 普魯蘭酶的SDS-PAGE圖

2.6 動力學參數

將普魯蘭酶與不同質量濃度的普魯蘭糖溶液保溫反應，測定反應速度，以反應速度的倒數為縱坐標（1/V），普魯蘭糖質量濃度的倒數（1/［S］）為橫坐標作Lineweaver-Burk圖，結果如圖8所示，從而得出普魯蘭酶米氏常數Km為0.24 mg/mL，Vm值為10.11 μmol/（min·mL）。

圖8 普魯蘭酶Lineweaver-Burk圖

3 結論

對實驗室篩選得到的具有較高酶活的菌株Halococcus sp.Z1、Bacillus amyloliquefaciens和Bacillus subtilis的酶學性質進行了簡單的初探，研究表明Halococcus sp.Z1所產普魯蘭酶最適反應溫度為60℃，在低于65℃范圍內較穩定，最適反應pH為5.0～5.4，在pH4.0～7.5范圍內較穩定。相對菌株Bacillus amyloliquefaciens和Bacillus subtilis所產酶而言，菌株Halococcus sp.Z1所產普魯蘭酶具有耐熱耐酸性質，較適合于工業生產應用。

對菌株Halococcus sp.Z1所產普魯蘭酶進行了分離純化，測得其相對分子質量為81 700，Km值為0.24 mg/mL。

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Purification and properties ofpullulanase

ZHOUNian-bo*
（Department ofbioengineering，Wuhan bioengineeringinstitute，Hubei Wuhan430415，China）

Heat-resistance and acid-resistance of pullulanase from Halococcus sp.Z1,Bacillus amyloliquefaciens and Bacillus subtilis was studied.The pullulanase from Halococcus sp.Z1 was purified by ammonium sulfate fractionation, dialysis,DEAE-SephadexA25 ion-exchange chromatographyand sephadexG-100 gel filtration,and partial enzymatic properties was examined.It is stable below65℃and within the pH range from4.0～7.5.Its optical temperature is 60℃and optical pH is 5.0～5.4.The purified pullulanase was demonstrated bySDS-PAGE tobe a homogeneous protein.The molecularweightofpullulanaseis8.17×104，andtheMichaelisconstantis0.24 mg/mL.

pullulanase；purification；property

TS201.2+5

A

1673-6044（2014）01-0037-04

10.3969/j.issn.1673-6044.2014.01.012

*周念波，男，1979年出生，2011年畢業于湖北大學生化與分子生物學專業，碩士，工程師。

2013-12-06