肝素類藥物防治阿爾采末病的研究進展

郝麗娜，趙孝林，吳學新

（山東大學齊魯兒童醫院藥學部，山東濟南250022）

肝素類藥物防治阿爾采末病的研究進展

郝麗娜，趙孝林，吳學新

（山東大學齊魯兒童醫院藥學部，山東濟南250022）

本文分析了阿爾采末?。ˋD）的病理機制，對肝素類藥物神經保護機制的進展進行了綜述。闡明了肝素類藥物可通過調節IP3受體介導的細胞內鈣釋放，影響淀粉樣蛋白（Aβ）沉積及其毒性、調節tau蛋白的磷酸化狀態，保護膽堿能神經元等發揮神經保護作用，從而延緩AD的發生與發展。

肝素；阿爾采末?。ˋD）；細胞內鈣；淀粉樣蛋白；tau蛋白；膽堿能神經元

阿爾采末病（Alzheimer′s disease，AD）是一種以進行性認知功能障礙和記憶力損害為主的中樞神經系統退行性疾病，是老年性癡呆最主要的類型。其典型的病理改變是在特定腦區出現選擇性的神經元和突觸丟失，淀粉樣蛋白（amyloid－β，Aβ）沉積形成的胞外老年斑（senile plaques，SP）和磷酸化的tau蛋白組成的細胞內神經元纖維纏結（neurofibrillary tangles，NFTs）的形成［1］。AD的發病機制復雜，20世紀80年代以來形成各種假說，但是對本病的病因和發病機制一直未完全明了，目前還缺乏特效的治療藥物。因此，開發新型有效的抗AD藥物具有重要的理論意義和廣闊的臨床應用價值。

1 肝素類藥物概述

肝素（heparin）是存在于體內的生物活性物質，1916年由McLean從肝臟中發現而得名。肝素是糖胺聚糖（glycosaminoglycan，GAG）家族中的成員之一，由重復的二糖單位組成，平均分子量范圍在12～14 kDa，附著于細胞膜和細胞外基質（extracellular matrix，ECM））。肝素在沿血管的肥大細胞顆粒中含量豐富，黏膜組織中也存在。當機體發生損傷時，肝素從這些顆粒中釋放入血液中從而發揮抗凝作用。近年來對肝素的研究已經擴大到非抗凝的范圍，包括抗炎、抗腫瘤、抗增殖、抗哮喘等作用［2］，肝素首次用于AD治療是源于它能通過抗血栓作用改善大腦微循環這一假設。但因其不能通過血腦屏障（blood－brain barrier，BBB）和進入細胞內，以及引起血小板減少和出血傾向等不良反應，阻礙了它在神經系統的應用。

低分子量肝素（low molecular weight heparin，LMWH）是由未分級肝素經化學或酶解方法降解而成的低分子量的片段，平均分子量約為5 kDa［3］。與肝素相比，低分子量肝素具有分子小、出血副作用少及良好的藥代動力學等特點［4］，在臨床上得到廣泛應用，目前上市的有達肝素鈉、依諾肝素、舍托肝素和亭扎肝素等。

超低分子量肝素（ultra low molecular weight heparin，ULMWH）由未分級肝素經進一步降解而成，其平均分子量為（2.0±0.2）kDa。由于其分子量較小，可能通過血腦屏障并在腦脊液（cerebro－spinal fluid，CSF）中分布［5］。而且，超分子量肝素保留了抗凝血酶（antithrombin，AT）活性位點的五糖結構而顯示出更好的療效和安全性［6］。本文現就肝素類藥物防治阿爾采默病作用的基礎性研究進展作一綜述。

2 肝素類藥物與阿爾采末病

2.1 肝素類藥物與細胞內鈣 Ca2＋是一種參與細胞內和細胞外很多過程的關鍵性離子，鈣信號已被證實可以調控各種細胞功能，包括基因表達，細胞生長、分化、自由基的形成和細胞死亡。在大腦中，神經細胞內生理濃度的Ca2＋是維持其生理功能所必需的，可以調節神經細胞的生理活動，包括膜興奮性、神經質合成、傳遞和釋放，突觸可塑性和學習記憶。而細胞內Ca2＋濃度的持續升高則會導致細胞凋亡、變形和壞死［7］。越來越多的證據表明，神經細胞內鈣穩態失衡（Calcium dysregulation）在AD的發病機制中起著核心作用，即所謂的“鈣超載學說”。

Németh等［2］發現，肝素能劑量依賴性地抑制Hela細胞中由組胺誘導的鈣動員，阻止細胞外鈣內流觸發的內鈣釋放，抑制RBL－2H3細胞中毒胡蘿卜素誘發的鈣庫耗竭。肝素也可作用于非容量性鈣通道（non－capacitive Ca2＋channel），防止自發性的鈣內流。此外，肝素能明顯地延遲經Triton－100處理后的細胞鈣離子以及其它二價陽離子的內流時間，但不減少這些陽離子的數量，說明肝素并不簡單地起陽離子螯合劑的作用，而可能是通過鈣庫操縱性鈣通道（store operated Ca2＋channels，SOCC）調節了容量性的鈣內流。

值得注意的是，肝素是一個明確的IP3受體的拮抗劑，早在1988年Ghosh等［8］就發現肝素可以競爭性地拮抗IP3所介導的細胞內鈣釋放，其主要原因在于肝素的一個或多個帶負電荷的N－端硫酸化氨基己糖殘基結構與IP3受體存在相似性，能夠直接與IP3結合位點交互作用，阻礙了IP3與受體結合，從而抑制了Ca2＋釋放。但由于肝素分子量較大不能透過細胞膜，因此在研究各種信號通路時，需采用顯微注射的方法將肝素直接注射到細胞內。Jonas等［9］將LMWH注入體外小腦切片的蒲肯野（Purkinje）細胞中發現，LMWH可通過阻斷IP3受體從而抑制谷氨酸誘導的細胞內鈣釋放，從而對細胞產生保護作用。最新的實驗研究發現，ULMWH可通過升高Bcl－2表達，降低Caspase－3表達抑制Aβ25－35所誘導的神經元凋亡。而且，ULMWH還可以在亞細胞水平上顯著降低 IP3誘導的 Ca2＋從內質網和線粒體釋放［10，11］。

另外，在平面脂雙層實驗中發現，肝素還能調節細胞內另一種鈣通道受體—蘭尼丁受體［12］（ryandodine receptor），但在細胞水平尚未被證實。

2.2 肝素類藥物與β淀粉樣蛋白（Aβ） Aβ是由正常存在于細胞膜上的淀粉樣前蛋白（amyloid precursor protein，APP）通過相應的分泌酶水解而成的纖維絲樣蛋白，由39～43個氨基酸殘基組成，分子量約為4 kDa。APP在體內有兩種代謝途徑［13］：①非淀粉源途徑：在α－分泌酶（α－secretase）作用下，APP第16位氨基酸殘基處發生裂解產生較大的N端片段sAPPa和小的跨膜片段（C83），sAPPa具有神經營養和神經保護作用；②淀粉源途徑：APP在β分泌酶（β－secretase，又稱β－site amyloid cleavage enzyme 1，BACE1）作用下于氨基端裂解，產生大的N端片段（sAPPβ）和一跨膜片段（C99），sAPPβ的40或42位點經γ分泌酶（γ－secretase）的作用水解形成Aβ1－40和Aβ1－42。Aβ1－42主要在受累患者的大腦組織中沉積，而Aβ1－40則主要集中在腦脊液。正常生理條件下，Aβ是微量、可溶性的，它的產生、降解和清除是一個動態平衡過程。但在AD患者腦內這種平衡被破壞，腦內微環境改變，Aβ通過與周圍因素相互作用，其羧基端自聚形成核因子，以核因子為核心的β－折疊，形成透明狀的β－原纖維，再經過連續的β－折疊，最終形成β－纖維絲。富含β－折疊結構的疏水區暴露，從而使Aβ聚集，進而沉積生成老年斑。Aβ的沉積可以激活一系列病理事件，包括星型膠質細胞和小膠質細胞的激活、血腦屏障的破環和微循環的變化等，是AD患者腦內老年斑周邊神經元變性和死亡的主要原因［14］。許多研究表明，肝素類藥物可以通過影響上述不同環節防止或延緩AD的進程。

2.2.1 抑制淀粉樣前蛋白（APP）的生成和分泌 Leveugle等［15］發現，不同分子量的肝素對APP的合成和分泌的作用完全不同，在神經母細胞瘤細胞中，全長的肝素可以刺激APP的合成和分泌；低分子量肝素對APP的分泌無顯著作用，但其片段尤其是肝素二糖可有效地抑制肝素對APP分泌的刺激作用，并阻止肝素與Aβ1－28的結合。而且，他們在體外模型中也進一步證實了低分子量肝素可以通過血腦屏障。

2.2.2 抑制β－纖維絲形成和沉積 給小鼠注射相當于臨床用量的依諾肝素和達肝素鈉，能使炎癥相關（inflammation－associated，AA）的淀粉樣蛋白沉積減少。體外分析表明，這些低分子量肝素可以通過抑制纖維形成必需的構象改變，從而阻止AA和Aβ肽纖維的生成［16］。Snow等［17］將Aβ與硫酸肝素一起注射到大鼠海馬區，結果表明Aβ不能形成纖維絲而沉積。

2.2.3 降低Aβ誘導的神經毒性及炎癥反應 體外實驗證明，肝素能劑量依賴性的降低Aβ1－42誘導的神經毒性，減少補體系統和解除系統的活性，補體系統和接觸系統是AD患者腦中炎癥反應的兩個主要效應因子，提示肝素能降低前炎癥反應（pro－inflammatory）活性［18］。采用依諾肝素治療過表達APP的轉基因小鼠，腹腔給藥，每周3次，每次6IU，6個月后可顯著降低皮層β淀粉樣沉積的數量和面積，以及整個皮層Aβ1－40的濃度。通過對神經膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）酶聯免疫分析，依諾肝素可顯著降低β淀粉樣沉積包繞的星型膠質細胞的數量。體外細胞實驗表明，依諾肝素也可以劑量依賴性地降低Aβ對神經細胞的毒性作用，抑制補體系統和接觸系統的激活［19］。

2.3 肝素類藥物與tau蛋白 微管是重要的細胞骨架成分，與有絲分裂、細胞內轉運等多種功能有關，微管由管蛋白（tubylin）和微管相關蛋白（tau蛋白含量最高）組成［20］。正常腦中tau蛋白能與成熟神經元的微管結合，促進微管形成，維持微管穩定性，降低微管蛋白分子的解離，并誘導微管成束。在正常成年人腦中，由于tau蛋白mRNA剪接方式不同，可產生6種同功異構體，由同一基因編碼，并受磷酸化、糖基化、泛素化等修飾。其中，tau蛋白磷酸化對其與微管的結合至關重要，正常情況下每分子tau蛋白有2～3個磷酸基，而AD患者腦中tau蛋白的磷酸化水平是正常人的3倍，每分子tau蛋白可含5～9個磷酸基。tau蛋白的超磷酸化可使其喪失生物學功能，導致其分子的聚集，形成配對螺旋樣纖維（pairedhelical filaments，PHF），進一步聚集可形成神經纖維纏結（NFT），且NFTs的數量與患者的癡呆程度呈正相關。Tau蛋白的這種變化可使微管結構崩解，進而使神經元發生退變。因此，tau蛋白的過度磷酸化被認為是AD的關鍵致病因素，抑制tau蛋白的過度磷酸化也成為AD治療的研究方向之一。那么，針對tau蛋白有兩種治療方法：抑制tau蛋白磷酸化或促進其脫磷酸化［21］。

tau蛋白的磷酸化和脫磷酸化水平主要受體內的蛋白激酶（protein kinase）和磷蛋白磷酸酶（phosphoprotein phosphatase，PP）調節，目前已知的調節tau蛋白磷酸化的酶有神經元cdc 2類激酶（neuronal cdc2－likekinase，NCLK），調節tau蛋白脫磷酸化的蛋白磷酸酶主要有三種：PP1，PP2A和PP2B，其中以PP2A和PP2B的作用最為突出。

Walzer等［22］采用杏仁核注射Aβ25－35（被認為是Aβ發揮毒性作用的片段）建立了模仿AD病理學的動物模型，發現低分子量肝素（舍托肝素和C6）能明顯減少tau蛋白的異常磷酸化和星型膠質細胞增多，而且這種作用與給藥時間以及分子量的大小密切相關，但并不影響Aβ的聚集狀態。低分子量肝素的這種保護作用需要一個長期的治療過程，推測可能通過成纖維細胞生長因子（fibroblast growth factors，FGF）發揮作用。

Dudas等［23］建立了海馬注射Aβ25－35大鼠模型，采用口服給予超低分子量肝素C3（25mg·kg－1，一日1次），于造模前3 d前給藥，連續口服17 d，或者皮下給予C3（2.5 mg·kg－1，一日兩次），連續注射36 d，結果表明C3可以顯著地降低Aβ所誘導的大鼠腦內海馬區域tau－2的免疫反應活性，促進神經元軸突和樹突生長。

2.4 肝素類藥物與膽堿能神經元 1982年，Bartus等提出了膽堿能假說，認為學習和記憶能力的喪失與前腦基底核和海馬區膽堿能神經功能的下降有著密切的聯系。對AD患者的病理研究顯示，其基底前腦膽堿能神經元明顯丟失，膽堿能神經纖維退變，患者腦脊液和腦組織中乙酰膽堿轉移酶（choline acetyltransferase，ChAT）和乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）的活性明顯下降，乙酰膽堿的合成、釋放、攝取等功能亦明顯下降。膽堿能神經元發生損害后可能會引起突觸減少甚至喪失，進而引起認知、記憶等多方面的功能障礙。腦內膽堿能神經系統的退變被認為是造成AD的最重要病理因素之一。

Rose等［24］采用大鼠雙側腦室內注射AF64A建立了膽堿能損傷模型，并于造模前7 d口服給予C3（25 mg·kg－1，一日1次），繼續口服7 d。研究發現，C3能減少AF64A所誘導的大鼠大腦隔膜和扣帶回中膽堿能神經元損傷。定量的神經元計數顯示，C3能使中隔膜的神經元丟失降低60%。酶分析顯示，C3還能明顯恢復顯著恢復AF64A所誘導的ChAT和AChE活性降低，提示C3能保護大腦內的膽堿能神經元，但是最佳給藥劑量和最優的給藥時間尚未可知。

進一步實驗顯示，口服給予5、10 mg·kg－1的C3，連續給藥14 d，或者給予25mg·kg－1的C3，僅造模前口服7 d或造模后口服7 d，均不會產生顯著作用，這說明C3能時間依賴性和劑量依賴性地降低AF64A誘導的膽堿能損傷［25］。這種時間依賴性也提示C3發揮作用可能是一個神經保護和修復的過程，其機制可能是通過調節NGF釋放和／或NGF受體的表達［26］。

3 結語

綜上所述，對神經退行性疾病的研究表明，肝素類藥物可以通過抑制IP3受體介導的細胞內鈣釋放，抑制APP生成和分泌，Aβ沉積以及Aβ所引起的毒性，調節tau蛋白的磷酸化狀態以及保護腦內的膽堿能神經細胞等來發揮其神經細胞保護作用，從而對抗AD所引起的一系列病理狀態。低分子量肝素和超低分子量肝素分子量小，易通過血腦屏障和透過細胞膜，加之副作用小等特點，更具備開發成治療AD新型藥物的前景。

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Research progress on the effects of heparins on Alzheimer′s disease

HAO Li-na，ZHAO Xiao-lin，WU Xue-xin
（Department of Pharmay，Qilu Children′s Hospital of Shandong University，Jinan 250022，China）

This paper analyzed the pathologicalmechanisms of AD，reviewed the progress of themechanisms of the neuroprotective effect of heparin and its derivatives，clarified thatheparin and its derivatives had neuroprotective effects through regulating IP3Rs－mediated intracellular calcium release，inhibiting Aβdeposition and Aβ－induced toxicity，regulating the tau protein phosphorylation state，and protecting cholinergic neurons，thereby delayed the occurrence and development of AD.

Heparin；Alzheimer′s disease；Intracellular calcium；Aβ（β－amyloid peptide）；Tau protein；Cholinergic neurons

R749

A

2095－5375（2014）11－0657－004

郝麗娜，女，博士研究生，主管藥師，研究方向：神經藥理學，E－mail：haolina1984＠163.com