腎細胞癌干細胞研究進展

陳健綜述 金承洛審校

綜 述

腎細胞癌干細胞研究進展

陳健綜述 金承洛審校

腫瘤；腎細胞癌；干細胞

腎細胞癌(renal cell carcinoma, RCC )的發(fā)病率在全身惡性腫瘤中占2%～3%[1]。腎癌細胞對化療、放療不敏感，具有多藥耐藥性[2]，而免疫治療僅對10%～20%患者有作用，手術(shù)切除是目前治療腎癌的首選，但腎癌術(shù)后復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移率高達40%[3]。2001年Reya等[4]提出了腫瘤干細胞學(xué)說，近年國內(nèi)外對RCC干細胞進行大量的研究，并關(guān)注RCC干細胞的靶向治療，希望找到RCC干細胞的特異性較高的表面標志物，探索RCC干細胞生存微環(huán)境，進而找到治療腎癌的新途徑，下文就近期腎癌干細胞的研究現(xiàn)狀作一綜述如下。

1 腫瘤干細胞及腎癌干細胞理論

在過去相當長的一段時間里， 腫瘤被認為是由腫瘤細胞構(gòu)成的均一組織，每個惡性腫瘤細胞都具備無限的增殖能力，只要生長環(huán)境適宜，每個腫瘤細胞都具有致瘤能力。1958年，Hewitt[5]把小鼠急性髓系白血病腫瘤細胞移植到同品系的小鼠體內(nèi)，發(fā)現(xiàn)這批移植小鼠體內(nèi)多數(shù)沒有形成腫瘤，僅有1%～4%能夠形成脾臟內(nèi)克隆，因此他們認為不是每個腫瘤細胞都具有無限的增殖能力，腫瘤細胞的致瘤能力可能是通過一小部分細胞表現(xiàn)出來的。數(shù)十年后，腫瘤干細胞學(xué)說的提出，認為腫瘤細胞之間存在固有差異[6]，在腫瘤組織中存在一小群具備自我更新和不定分化潛能的細胞，是腫瘤形成的起始細胞并維持腫瘤的生長，而其他絕大部分腫瘤細胞只具備有限的增殖能力。Al-Awqati等[7]提出了RCC干細胞的假設(shè)，認為RCC主要是由致癌性能的RCC干細胞和無致癌性能的其他細胞組成，RCC干細胞很可能是RCC的種子細胞，可能來源于近端腎小管祖細胞等腎臟細胞。Bonnet 等[8]成功分離出人類AML干細胞，腫瘤干細胞假設(shè)的理論逐步得到了證實。此后在腦腫瘤[9]、前列腺癌[10]等實體瘤中也證實了腫瘤干細胞的存在。目前認為腫瘤干細胞(cancer stem cells，CSCs)/(tumor stem cells，TSCs)是一群存在腫瘤組織中數(shù)目極少的干細胞樣細胞，具有干細胞所具有的自我更新能力和多向分化增殖潛能，是腫瘤發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移的起始細胞[11]，腫瘤干細胞理論仍處起始階段，我們所說的腫瘤干細胞，是因為這種細胞在某些方面表現(xiàn)出了干細胞的特性，所以有些文獻稱之為Cancer stem-like cells 或tumor-initiating cells 。

早在腫瘤干細胞理論提出之前,Bander 等[12]應(yīng)用單克隆抗體探針技術(shù)研究腎癌細胞起源的過程中發(fā)現(xiàn)腎癌組織中，小部分細胞表型和正常胎兒近端腎小管祖細胞表型一致，表達相同的抗原。胚胎時期的腎臟細胞和小部分的腎癌組織細胞均產(chǎn)生大量轉(zhuǎn)化生長因子α((TGF-α)，而正常成熟腎臟細胞則沒有檢測到此因子的表達。根據(jù)以上結(jié)果可推斷，RCC細胞中小部分細胞的特性與胚胎時期腎臟部分細胞極為相似，提示了RCC干細胞存在可能。直到2005年，F(xiàn)lorek 等[13]利用體外球體形成實驗從腎癌細胞中首次發(fā)現(xiàn)RCC干細胞，證實了腎癌干細胞的存在。目前基于腎癌組織中這種干樣細胞存在的理解有2種：(1)這種表現(xiàn)出干細胞特性的干樣細胞可能是位于腎癌組織中的正常腎臟干細胞，在腫瘤組織中促進腫瘤生長和血管形成；(2)也可能是正常的腎臟干細胞惡化后形成的最原始的腫瘤細胞，在不同微環(huán)境誘導(dǎo)下分化形成具有不同特性的腫瘤細胞群，進而形成不同病理類型和不同惡性程度的腫瘤組織。

2 腎癌(腫瘤)干細胞標志物

2.2 三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運蛋白G超家族成員2( ATP-binding cassette transporter,ABCG2)ABCG2 作為一種跨膜轉(zhuǎn)運蛋白,是由655個氨基酸組成的，具有6個跨膜區(qū)和1個核結(jié)合區(qū)[17]。當用DNA熒光染料Hoechest33342對不同的細胞進行染色時，某些腫瘤細胞和干細胞表現(xiàn)為細胞核不著色或者很低程度的著色，研究者們將這部分細胞稱為側(cè)群(SP)細胞，SP細胞高表達ABCG2。研究者們證實腎癌組織中分布有SP細胞，也高表達ABCG2。腎癌具有對化療不敏感、多藥耐藥性的特點，而ABCG2的主要作用恰恰就是把包括化療藥物在內(nèi)的多種藥物泵出細胞外[18]，進而使得腫瘤組織表現(xiàn)出耐藥性。由此可以推測SP細胞標記物ABCG2在腎癌的耐藥中可能起著關(guān)鍵的作用，所以ABCG2有理由成為腎癌干細胞的表面標志物，但是其特異性還有待檢測。

2.3 Oct-4 Oct-4是一種在胚胎干細胞和精原細胞中表達的轉(zhuǎn)錄因子，是維持胚胎干細胞的多分化潛能的重要因子，增殖不旺盛或者成熟的分化組織中一般檢測不到Oct-4的存在，通常認為是胚胎干細胞的標記物。研究者們發(fā)現(xiàn)Oct-4在絕大多數(shù)的RCC標本中呈陽性表達[19]，而正常腎皮質(zhì)組織和癌旁組織中未檢測到Oct-4表達。Oct-4已經(jīng)證實的作用為維持細胞的分化潛能[20]，癌組織中只有一小部分細胞具有這種能力，Oct-4可能就表達在腫瘤干樣細胞。研究者們只是證實了腎癌組織中Oct-4的高表達，還未能在單個特定細胞上明確其表達。

2.4 BMI-1 BMI-1基因是多梳基因(polycomb group gene)家族重要的調(diào)節(jié)基因，調(diào)節(jié)同源盒基因的轉(zhuǎn)錄，抑制細胞周期蛋白激酶抑制基因p16Ink4a表達，在維持正常干細胞自我更新和多向分化方面起到重要作用。BMI-1的表達主要分布于胞漿，大部分呈彌漫性全漿分布，少數(shù)分布于胞核或胞核周圍[21]；研究表明BMI- 1表達陽性率與腎透明細胞癌的分化程度呈反比,推測其參與了腎癌的發(fā)生，Liu 等[22]發(fā)現(xiàn)BMI-1 的表達與腫瘤組織內(nèi)干樣細胞對腫瘤組織的調(diào)節(jié)有關(guān)。除腎癌外，BMI-1基因在維持促白血病干細胞、乳腺癌干細胞等腫瘤干細胞增殖能力方面的作用已經(jīng)得到證實。因此有理由根據(jù)BMI-1 的表達鑒別腎癌干細胞。

3 腎癌干細胞的培養(yǎng)及篩選方法

3.1 SP細胞分選法 基于腫瘤干細胞細胞膜上ABCG2跨膜轉(zhuǎn)運蛋白能將DNA結(jié)合染料排出細胞而不被染色的特性，采用熒光激活細胞分類術(shù)(FACS)技術(shù)就可以從單細胞懸液中分選出不染色的SP細胞。

3.3 體外球體形成實驗 體外球體形成實驗已經(jīng)被認為是一種有用的腫瘤干細胞的培養(yǎng)和分離方法。從腦腫瘤組織中分離得到的細胞懸浮于含有表皮生長因子(EGF)和成纖維生長因子(bFGF)的無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)，小部分細胞能生長為一個細胞球體[23]。這部分細胞展現(xiàn)出自我更新能力、更高的干細胞樣基因mRNA表達水平，更強的致瘤性以及對抗腫瘤藥物的更頑強的抵抗能力。有研究證實[24]，在非附著培養(yǎng)條件下，以多細胞球或者球形細胞聚集體方式形成集落的能力是許多具有自我更新能力細胞的一種特點。在此方法指導(dǎo)下，2005年Florek等[13]從腎癌組織中發(fā)現(xiàn)腎癌干細胞的存在。

3.4 利用干細胞慢周期的特性分離提取 溴脫氧尿苷(bromodeoxyuridine，BrdU)能夠在細胞處于S期時，滲入細胞中標記到新合成的DNA鏈中，能夠標記到細胞周期較長的成體干細胞中并能保留較長的時間，在細胞免疫組化中應(yīng)用廣泛。2004年，Oliver等[25]利用BrdU此特性，追蹤觀察了正常腎臟干細胞，發(fā)現(xiàn)腎乳頭是腎臟干細胞集中的部位。這種細胞在腎臟受到損傷，特別是缺血性損傷的時候就會進入細胞周期，參與病損修復(fù)。體外培養(yǎng)這種細胞，表現(xiàn)出極強的增殖能力和多能性[26]，因此認為這些細胞就是腎臟干細胞，關(guān)于腎癌干細胞，目前還沒有用此染料追蹤尋找的案例，但Oliver的實驗對于腎癌干細胞的篩選具有指導(dǎo)意義。

4 以腫瘤干細胞為靶點治療癌癥的初嘗試

分析腫瘤干細胞表面特異性標志物，尋找到腫瘤干細胞特異性表達抗原，根據(jù)此標志物抗原，尋找及利用相應(yīng)抗體，達到抗腫瘤干細胞的作用，從而起到抗腫瘤的作用。此方法首次在AML中取得了突破性進展，研究者們用一種腫瘤干細胞標志物CD44的抗體[28]，清除了接種AML的免疫缺陷小鼠體內(nèi)的AML干細胞。此方法尚未在實體腫瘤中嘗試過，但對于腎癌等實體腫瘤具有指導(dǎo)意義。

研究者發(fā)現(xiàn)利用細胞因子IL-15處理腎癌干細胞，對常規(guī)抗腫瘤藥物更敏感[29]。Azzi等[30]利用對比實驗證實接觸過白介素-15的腎腫瘤組織對順鉑、長春堿、紫杉醇等常規(guī)抗腫瘤藥物更敏感。對比結(jié)果示IL-15處理后的標本腎癌干細胞的數(shù)量明顯減少，IL-15如何導(dǎo)致腎癌干細胞減少的機制不明確，但是腎癌干細胞較少的腎癌組織對抗腫瘤藥物敏感，很有可能是由于腎癌干細胞缺失，降低了腎癌組織耐藥性所致[31]。

5 意義及展望

腫瘤干細胞理論的提出，使人們對包括腎癌在內(nèi)的多種惡性腫瘤的認識發(fā)生了革命性的變化，基于腎癌干細胞的研究進展，進一步推動了對腫瘤干細胞各種生物學(xué)特征和生物學(xué)行為分子機制的探索，為重新認識腫瘤的起源和本質(zhì)，以及腫瘤的臨床治療提供了新的明確可靠的方向。

但是，作為目前生命科學(xué)領(lǐng)域的研究熱點，腫瘤干細胞研究在面臨巨大機遇的同時也面臨巨大挑戰(zhàn)。正如前文所述，腫瘤干細胞的起源問題還未定論；其特異性的表面標志物[32]和獨特的信號通路還有待于進一步的尋找和認識；分離和鑒定技術(shù)還不是十分成熟等。腎癌干細胞的研究起步較晚，與乳腺癌干細胞、腦膠質(zhì)瘤干細胞等相對較成熟的腫瘤干細胞研究相比，腎癌干細胞研究處于起始階段。隨著干細胞研究技術(shù)和應(yīng)用水平的不斷深入，腎癌干細胞特異性標志物、基因靶位將會逐步被發(fā)現(xiàn)，P13K-AKT-mTOR、EGFR、Wnt等[33]信號通路與腫瘤的關(guān)系將更加明了；腎癌干細胞特異細胞周期與不對稱分裂的機制將被明確、利用微環(huán)境的調(diào)控及靶向藥物治療腎癌將成為可能，到那時腎癌等惡性腫瘤會被徹底根治，造福人類。

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150086 哈爾濱醫(yī)科大學(xué)第二附屬醫(yī)院泌尿外科

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