TFPI-2對動脈粥樣硬化斑塊不穩定相關因素影響的研究進展

于 佳(綜述)，羅心平，倪喚春(審校)

(復旦大學附屬華山醫院心內科，上海 200040)

組織因子途徑抑制物(tissue factor pathway inhibitor，TFPI)2最初被稱為胎盤蛋白5，是近來發現的一類絲氨酸蛋白酶抑制劑[1]。1979年，Jandial等[2]首次在雙胞胎妊娠者體內發現該蛋白并將其命名為胎盤蛋白5[2]，后來研究發現胎盤蛋白5與TFPI的氨基酸序列具有高度同源性,且兩者性質具有一定相似性，故最終命名為TFPI-2[3]。TFPI-2參與調控組織因子、基質金屬蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)、血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cell,VSMC)的功能，影響粥樣硬化斑塊穩定性，該文就TFPI-2對動脈粥樣硬化斑塊不穩定相關因素作用的研究進展予以綜述。

1 TFPI-2的體內表達及分布

人TFPI-2基因位于染色體7q22，全長約7 kb，包括5′非編碼區、結構基因和3′非編碼區，5′非編碼區含有多個順式作用元件，結構基因含有5個外顯子和4個內含子，內含子和外顯子之間的交界處遵循GT-AG規律(是指在內含子和外顯子交界處有兩個相當短的保守序列：5′端為GT,3′端為AG)[4]。TFPI-2基因的啟動子區域富含GC，缺乏典型的TATA和CAAT盒，3個轉錄起始點已被識別[5]。TFPI-2基因的啟動子保持持家基因的典型特點，Hubé等[6]發現，TFPI-2基因的啟動子內核因子1、核因子κB和egr-1/Sp1結合位點高度保守，推測對TPFI-2的誘導性表達調控具有重要作用。

TFPI-2廣泛分布于人體組織，包括胎盤、肝臟、骨骼肌、心臟、腎臟和胰腺等。多種細胞可合成分泌TFPI-2，包括內皮細胞、角質形成細胞、成纖維細胞、胎盤滋養層細胞等，內皮細胞合成的60%～90%TFPI-2直接分泌至細胞外基質(extracellular matrix,ECM)。

TFPI-2在動脈粥樣硬化組織中表達量增加。Crawley等[7]發現在正常人血管內，TFPI-2僅表達于血管內皮，而在動脈粥樣硬化組織中，TFPI-2表達于巨噬細胞、T淋巴細胞、內皮細胞和VSMC，培養人主動脈VSMC、U937細胞(單核細胞)和Jurkat細胞株可獲得TFPI-2進一步明確以上結論。

TFPI-2同時存在于細胞核和細胞質內，亦可能在細胞核內發揮作用。Kempaiah等[8-9]發現外源性和內源性TFPI-2均可在核轉運蛋白作用下進入細胞質和細胞核，進一步研究發現在TFPI-2的191～211殘基間存在二連核定位信號序列，推測TFPI-2通過核定位信號與輸入蛋白α形成胞質復合體后與輸入蛋白β相互作用，輸入蛋白β作為分子伴侶協助三元復合體通過核孔復合體進入細胞核，提示TFPI-2可能在細胞核內發揮功能。

2 TFPI-2抑制體內蛋白酶的結構基礎

TFPI-2是一類Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑，相對分子質量為32×103，由235個氨基酸組成。TFPI-2蛋白結構包括短N端、3個串聯Kunitz結構域(KD)、富含基本氨基酸的C端。KD1可抑制多種絲氨酸蛋白酶活性，包括組織因子/FⅦa復合體、TⅪa、胰蛋白酶、糜蛋白酶、激肽釋放酶以及纖溶酶等，該蛋白酶的選擇性抑制作用通過精氨酸殘基(R24)實現，R24組成的P1殘基是以上蛋白酶的識別位點[10-11]。KD1對纖溶酶的抑制作用特異性差，KD1在抑制內源性凝血途徑和外源性凝血途徑的同時也能抑制纖溶酶，其抗凝血作用減弱抗纖溶作用，如果將KD1的Leu-17殘基改為Arg后，其抗纖溶作用增強但不再具有抗促凝作用[12]。KD2亦參與纖溶酶活性抑制過程，研究發現在動脈粥樣硬化病變處，TFPI-2、高分子量緩激肽、激肽原結合蛋白(gC1Qr/p33)的分布相似，gC1Qr/p33參與凝血等過程，提示TFPI-2依賴KD2與gC1Qr/p33形成特異性結合從而減弱TFPI-2對纖溶酶活性的抑制作用[13]。此外，KD2對FⅩa活性亦有抑制作用。KD3參與結合脂蛋白，形成游離TFPI-2，具有肝素結合位點，對肝素鈣具有活性，可結合蛋白S，增強對FⅩa的抑制作用[14]。C端具有糖基磷脂酰肌醇錨定位點，以直接糖基磷脂酰肌醇介導的膜錨定方式在細胞表面定位[15-16]。

3 TFPI-2對動脈粥樣硬化斑塊不穩定相關因素的影響

動脈粥樣硬化不穩定斑塊以巨大脂質核心、炎性細胞聚集、薄的纖維帽為特征。隨著斑塊炎癥的進展，MMP引起的凋亡和基質降解的作用突出，病變內壞死物質堆積、炎性纖維帽變薄，斑塊炎癥還造成氧化損傷增加。缺氧誘導斑塊內微血管的病理性增生，導致外膜微血管延伸通過中膜直至斑塊，這些新生病理性微血管構成的內皮完整性很容易受破壞后形成外漏和斑塊內出血，斑塊內凝血酶原激活物形成、凝血瀑布啟動，進而斑塊穩定性下降。由此可見，內皮細胞及巨噬細胞的功能、VSMC增殖狀況、MMP及凝血酶活性是動脈粥樣硬化斑塊不穩定的重要相關因素。TFPI-2對纖溶酶、血漿激肽釋放酶、MMP、組織因子/FⅦa復合體、FⅨa、組織蛋白酶G等具有較強的抑制作用，已有不少文獻研究TFPI-2在動脈粥樣硬化過程中的作用。

3.1TFPI-2與基質金屬蛋白酶 MMP是一類Zn2+依賴性蛋白內肽酶，以酶原形式分泌，經其他絲氨酸蛋白酶，如纖溶酶激活后具有降解ECM蛋白的作用，與血管重塑過程保持協調，MMP系統失調控是斑塊破裂的重要因素之一。MMP家族包含25個酶，具有不同底物活性。病理學研究顯示間質膠原酶，即MMP-1在動脈粥樣硬化斑塊的纖維帽和肩部區域大量表達[17]。溶基質蛋白酶1，即MMP-3作用底物廣泛，被認為是其他MMP家族成員的上游活化劑，免疫組織化學分析顯示MMP-3對VSMC增殖和結締組織重塑過程非常重要，與動脈粥樣硬化和斑塊破裂相關[18]。明膠酶B，即MMP-9具有降解Ⅳ型膠原活性，促使VSMC遷移，MMP-9在動脈粥樣硬化斑塊破裂處高度表達。動脈粥樣硬化斑塊內的各種細胞尤其是轉化為合成型的VSMC表達多種MMP，如MMP-1、-2、-3、-9、-14等，而TFPI-2原位表達與MMP水平呈負相關。

TPIF-2間接調控MMP活化。Rao等[19]發現TFPI-2可抑制纖溶酶和胰蛋白酶，將相對分子質量為53×103的proMMP-1轉化為部分活化型43×103的多肽、將相對分子質量為66×103的proMMP-3轉化為活化型45×103多肽的過程，實現間接調控MMP-1和MMP-3催化基質的酶解。Du等[20]研究TFPI-2抑制MMP的結構區域，免疫沉淀和配體印記結果顯示，TFPI-2并不能與MMP-2、-9、-1和活化MMP-1形成雙分子復合物，TFPI-2對活化MMP-1酶解三螺旋膠原的活性沒有影響，提示在體內TFPI-2可能不是直接調控MMP-1介導的ECM降解，而是調控胰蛋白酶樣絲氨酸蛋白酶活化proMMP的過程。

TFPI-2直接抑制MMP活性。Herman等[21]研究證實，TFPI-2是MMP抑制劑，強烈抑制MMP-1和MMP-13降解三螺旋膠原的活性，而三螺旋膠原是動脈粥樣硬化斑塊ECM的主要承載分子，TFPI-2對MMP-2和MMP-9活性也有弱抑制作用。Zhao等[22]發現，TFPI-2過表達可抑制人源氧化低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein，ox-LDL)誘導MMP-2、-9活性。Pan等[23]研究apoE-/-小鼠發現，TFPI-2過表達可抑制MMP以提供動脈粥樣硬化斑塊穩定性。

3.2TFPI-2與凝血酶 凝血酶是專一性很強的絲氨酸蛋白質水解酶，可直接催化纖維蛋白原為纖維蛋白，激活血管內皮細胞釋放MMP和表達黏附分子，刺激VSMC增生和遷移，造成內皮功能紊亂，凝血系統活性增加，纖維蛋白溶解系統活性降低，血管性血友病因子、組織因子等促凝活性物質過度激活，血液處于高凝狀態，增加血栓形成危險，促進動脈粥樣硬化形成和斑塊不穩定。

凝血酶上調TFPI-2表達，但其具體機制尚未明確。Neaud等[24]發現凝血酶通過環加氧酶2依賴、上皮生長因子受體非依賴介導機制，上調TFPI-2的mRNA和蛋白表達。Pou等[25]研究發現，凝血酶誘導THP-1巨噬細胞和人單核細胞來源巨噬細胞的TFPI-2表達增加1.9倍和2.3倍，同時胞外信號調節激酶1/2和c-Jun氨基端激酶磷?；虸κB水平增加，結合已知TFPI-2基因啟動子區域具有核因子κB結合位點，IκB磷酰化經IκB催化，IκB激酶可由胞外信號調節激酶1等多個激酶激活，因此推測，凝血酶通過磷酰化胞外信號調節激酶1/2和c-Jun氨基端激酶最終激活核因子κB的途徑誘導TFPI-2表達，同時研究結果不支持表皮生長因子、轉錄因子激活子蛋白1、環加氧酶2參與作用機制。凝血酶生成增加可能是動脈粥樣硬化嚴重的標志。Borissoff等[26]研究顯示，冠狀動脈粥樣硬化性心臟病患者體內凝血酶-抗凝血酶復合物血漿水平顯著升高，體內凝血酶生成與動脈粥樣硬化嚴重度之間具有獨立相關性，提示凝血酶在動脈粥樣硬化進程中可能起作用。

3.3TFPI-2與脂蛋白 高水平LDL、低水平HDL是形成動脈粥樣硬化斑塊的危險因素之一，在動脈粥樣硬化進程中ox-LDL集聚是一個重要步驟。Llaverias等[27]發現家族性混合型高脂血癥患者單核細胞內TFPI-2表達升高，推測TFPI-2表達受HDL水平調控，極低密度脂蛋白過度生成和血漿高水平是該病的主要特點之一，但是進一步研究發現極低密度脂蛋白并不能誘導巨噬細胞表達TFPI-2。Zhao等[22]研究顯示，ox-LDL可下調VSMC的TFPI-2表達，造成不利斑塊穩定環境。

3.4TFPI-2與血管平滑肌細胞 動脈粥樣硬化斑塊處大量VSMC活化并合成基質，分布于VSMC的TFPI-2更受關注。TFPI-2調控VSMC的增殖和遷移。Shinoda等[28]發現，TFPI-2誘導VSMC增生和形態學改變，提出TFPI-2是VSMC的促細胞分裂劑。Zhao等[22]發現，TFPI-2過表達可強烈抑制VSMC的增殖和遷移，推測可能與其作為絲氨酸蛋白酶抑制劑抑制MMP-2、-9的活性相關，也可能通過對細胞周期蛋白D1及細胞增殖遷移相關信號轉導通路絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶(Akt)、黏著斑激酶、STATS磷酸化的抑制。

TFPI-2對VSMC的作用受流體應切力影響。Ekstrand等[29]研究顯示，鼠頸動脈球囊損傷后新生內膜內的VSMC暴露于流體應切力環境時，VSMC同時表達TFPI-2和胱天蛋白酶3，TFPI-2的mRNA和蛋白表達量增加，推測流體應切力影響VSMC基因表達從而抑制增殖和誘導凋亡，通過調控VSMC增殖存活來參與修復血管壁。

3.5TFPI-2與內皮細胞 血管新生時ECM的重塑主要通過細胞周圍纖溶酶依賴性蛋白酶解和MMP作用，內皮細胞表達的TFPI-2在ECM內顯著分布，可抑制纖溶酶和MMP活性。TFPI-2抑制血管新生。Xu等[30]研究TFPI-2在內皮細胞內的表達調控以及對內皮細胞功能的調控，發現血管內皮生長因子以絲裂原-細胞外激酶依賴的方式誘導內皮細胞表達TFPI-2的mRNA和蛋白，進一步發現重組TFPI-2可抑制血管內皮細胞生長因子誘導內皮細胞增殖和遷移的作用，重組KD1可抑制血管內皮生長因子誘導的遷移但對血管內皮細胞生長因子誘導的增殖無抑制作用，TFPI-2可抑制血管內皮生長因子誘導的胞外信號調節激酶和Akt的活化，這些結果提示了TFPI-2通過直接抑制內皮細胞起到抗血管形成的作用，是TFPI-2對血管新生疾病的潛在治療作用機制。TFPI-2抑制內皮細胞遷移。Ivanciu等[31]研究TFPI-2表達對內皮細胞遷移和血管發生的作用，發現遷移中的內皮細胞表達更多TFPI-2的mRNA和蛋白，另外腺病毒介導的TFPI-2過表達可減少新生血管形成、促進ECM降解和促進凋亡，同時纖維蛋白原缺如，推測TFPI-2通過抑制纖溶酶來抑制內皮細胞遷移。

3.6TFPI-2與巨噬細胞 巨噬細胞不斷吞噬ox-LDL后最終變為泡沫細胞，并產生一系列趨化分子等募集更多炎性細胞，加速動脈粥樣硬化發展。TFPI-2促進巨噬細胞細胞凋亡。凝血酶等刺激因素可促進巨噬細胞的TFPI-2表達量增加，而重組TFPI-2可通過Fas/FasL信號通路促使U937來源巨噬細胞的凋亡，提示TFPI-2可能具有抗致動脈粥樣硬化作用[25,32]。

4 小 結

TFPI-2是一類相對分子質量為32×103的Kunitz型絲氨酸蛋白酶抑制劑，表達于內皮細胞、平滑肌細胞等多種細胞，在動脈粥樣硬化斑塊處高度分布。TFPI-2抑制MMP活性，使其無法水解胞外基質中的大分子物質，減少胞外基質降解，因此TFPI-2作為MMP內源性抑制物在維持和調節ECM重塑過程中起關鍵作用，具有穩定粥樣硬化斑塊的作用。此外，還抑制內皮細胞和血管平滑肌細胞等的增殖和遷移，促進巨噬細胞細胞凋亡，從而延緩動脈粥樣硬化的進展，保護斑塊穩定性。TFPI-2在動脈粥樣硬化發展中的信號調控機制和功能研究日漸深入，必將展現廣闊的臨床應用前景。

[1] Kisiel W,Sprecher CA,Foster DC.Evidence that a second human tissue factor pathway inhibitor(TFPI-2) and human placental protein 5 are equivalent[J].Blood,1994,84(12):4384-4385.

[2] Jandial V,Horne CH,Glover RG，etal.The value of measurement of pregnancy-specific proteins in twin pregnancies[J].Acta Genet Med Gemellol(Roma),1979,28(4):p.319-325.

[3] Miyagi Y,Koshikawa N,Yasumitsu H.cDNA cloning and mRNA expression of a serine proteinase inhibitor secreted by cancer cells:identification as placental protein 5 and tissue factor pathway inhibitor-2[J].J Biochem,1994,16(5):939-942.

[4] Kamei S,Kazama Y,Kuijper JL,etal.Genomic structure and promoter activity of the human tissue factor pathway inhibitor-2 gene[J].Biochim Biophys Acta,2001,1517(3):430-435.

[5] Siegling S,Thyzel E,Brinkmann T,etal.Genetic variations in the human TFPI-2 gene and its promoter region by denaturing high performance liquid chromatography[J].Thromb Res,2004,113(5):341-343.

[6] Hubé F,Reverdiau P,Iochmann S,etal.Characterization and functional analysis of TFPI-2 gene promoter in a human choriocarcinoma cell line[J].Thromb Res,2003,109(4):207-215.

[7] Crawley JT,Goulding DA,Ferreira V,etal.Expression and localization of tissue factor pathway inhibitor-2 in normal and atherosclerotic human vessels[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2002,22(2):218-224.

[8] Kempaiah P,Kisiel W.Human tissue factor pathway inhibitor-2 induces caspase-mediated apoptosis in a human fibrosarcoma cell line[J].Apoptosis,2008,13(5):702-715.

[9] Kempaiah P,Chand HS,Kisiel W.Human tissue factor pathway inhibitor-2 is internalized by cells and translocated to the nucleus by the importin system[J].Arch Biochem Biophys,2009,482(1/2):58-65.

[10] Schmidt AE,Chand HS,Cascio D,etal.Crystal structure of Kunitz domain 1(KD1) of tissue factor pathway inhibitor-2 in complex with trypsin.Implications for KD1 specificity of inhibition[J].J Biol Chem,2005,280(30):27832-27838.

[11] Kamei S,Petersen LC,Sprecher CA,etal.Inhibitory properties of human recombinant Arg24-->Gln type-2 tissue factor pathway inhibitor(R24Q TFPI-2)[J].Thromb Res,1999,94(3):147-152.

[12] Bajaj MS,Ogueli GI,Kumar Y,etal.Engineering kunitz domain 1(KD1) of human tissue factor pathway inhibitor-2 to selectively inhibit fibrinolysis:properties of KD1-L17R variant[J].J Biol Chem,2011,286(6):4329-4340.

[13] Peerschke EI,Petrovan RJ,Ghebrehiwet B,etal.Tissue factor pathway inhibitor-2(TFPI-2) recognizes the complement and kininogen binding protein gC1qR/p33(gC1qR):implications for vascular inflammation[J].Thromb Haemost,2004,92(4):811-819.

[14] Zhu L,Wang J,Mu J,etal.Expression and characterization of Kunitz domain 3 and C-terminal of human tissue factor pathway inhibitor-2[J].Acta Biochim Biophys Sin(Shanghai),2009,41(11):948-954.

[15] Girard TJ,Tuley E,Broze GJ Jr.TFPIβ is the GPI-anchored TFPI isoform on human endothelial cells and placental microsomes[J].Blood,2012,119(5):1256-1262.

[16] Zhang J,Piro O,Lu L,etal.Glycosyl phosphatidylinositol anchorage of tissue factor pathway inhibitor[J].Circulation,2003,108(5):623-627.

[17] Nikkari ST,O′Brien KD,Ferguson M,etal.Interstitial collagenase(MMP-1) expression in human carotid atherosclerosis[J].Circulation,1995,92(6):1393-1398.

[18] Johnson JL，Dwivedi A,Somerville M,etal.Matrix metalloproteinase(MMP)-3 activates MMP-9 mediated vascular smooth muscle cell migration and neointima formation in mice[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol，2011,31(9):e35-e44.

[19] Rao CN,Mohanam S,Puppala A,etal.Regulation of ProMMP-1 and ProMMP-3 activation by tissue factor pathway inhibitor-2/matrix-associated serine protease inhibitor[J].Biochem Biophys Res Commun,1999,255(1):94-98.

[20] Du X,Chand HS,Kisiel W.Human tissue factor pathway inhibitor-2 does not bind or inhibit activated matrix metalloproteinase-1[J].Biochim Biophys Acta,2003,1621(3):242-245.

[21] Herman MP,Sukhova GK,Kisiel W,etal.Tissue factor pathway inhibitor-2 is a novel inhibitor of matrix metalloproteinases with implications for atherosclerosis[J].J Clin Invest,2001,107(9):1117-1126.

[22] Zhao B,Luo X,Shi H,etal.Tissue factor pathway inhibitor-2 is downregulated by ox-LDL and inhibits ox-LDL induced vascular smooth muscle cells proliferation and migration[J].Thromb Res,2011,128(2):179-185.

[23] Pan J,Ma D,Sun F,etal.Over-expression of TFPI-2 promotes atherosclerotic plaque stability by inhibiting MMPs in apoE-/-mice[J].Int J Cardiol,2013,168(2):1691-1697.

[24] Neaud V,Duplantier JG,Mazzocco C,etal.Thrombin up-regulates tissue factor pathway inhibitor-2 synthesis through a cyclooxygenase-2-dependent,epidermal growth factor receptor-independent mechanism[J].J Biol Chem,2004,279(7):5200-5206.

[25] Pou J,Rebollo A,Piera L,etal.Tissue factor pathway inhibitor 2 is induced by thrombin in human macrophages[J].Biochim Biophys Acta,2011,1813(6):1254-1260.

[26] Borissoff JI,Joosen IA,Versteylen MO,etal.Accelerated in vivo thrombin formation independently predicts the presence and severity of CT angiographic coronary atherosclerosis[J].JACC Cardiovasc Imaging,2012,5(12):1201-1210.

[27] Llaverias G,Pou J,Ros E,etal.Monocyte gene-expression profile in men with familial combined hyperlipidemia and its modification by atorvastatin treatment[J].Pharmacogenomics,2008,9(8):1035-1054.

[28] Shinoda E,Yui Y,Hattori R,etal.Tissue factor pathway inhibitor-2 is a novel mitogen for vascular smooth muscle cells[J].J Biol Chem,1999,274(9):5379-5384.

[29] Ekstrand J,Razuvaev A,Folkersen L,etal.Tissue factor pathway inhibitor-2 is induced by fluid shear stress in vascular smooth muscle cells and affects cell proliferation and survival[J].J Vasc Surg,2010,52(1):167-175.

[30] Xu Z,Maiti D,Kisiel W,etal.Tissue factor pathway inhibitor-2 is upregulated by vascular endothelial growth factor and suppresses growth factor-induced proliferation of endothelial cells[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2006,26(12):2819-2825.

[31] Ivanciu L,Gerard RD,Tang H,etal.Adenovirus-mediated expression of tissue factor pathway inhibitor-2 inhibits endothelial cell migration and angiogenesis[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2007,27(2):310-316.

[32] Pan JJ,Shi HM,Luo XP,etal.Recombinant TFPI-2 enhances macrophage apoptosis through upregulation of Fas/FasL[J].Eur J Pharmacol,2011,654(2):135-141