脫落細胞學的細胞塊制作及應用的研究進展

林 靜(綜述)，周英瓊(審校)

(桂林醫學院附屬醫院病理科，廣西 桂林 541001)

常用脫落細胞學標本包括痰液、尿液、漿膜腔積液(胸腔、腹腔、心包腔積液)、灌洗液、穿刺標本等。由于取材方便、經濟、快速、無創或微創使脫落細胞學檢查成為臨床進行疾病篩查、診斷和研究的一種重要手段。目前在基層單位，大部分細胞學檢查停留在將送檢樣本涂片直接染色觀察這一較為傳統的模式上,而傳統涂片方式由于涂片厚、細胞重疊、結構不清、細胞量少，使細胞學的陽性檢出率和敏感性均不高。細胞塊技術是基于細胞學的組織塊技術，能夠增加細胞學檢出的陽性率并提高準確性，適于在基層醫院推廣。

1 傳統脫落細胞學制備方法及局限性

傳統脫落細胞學通常采用離心5 min(2000 r/min)后直接涂片、蘇木素-伊紅(hematoxylin-eosin staining，HE)染色或瑞氏染色觀察結果。由于傳統涂片收集的細胞有時較少、組織形態不典型等使細胞學檢查易存在假陰性，涂片厚薄不均而導致陽性物質定位不清出現假陽性[1-2]。另外，在診斷上還有組織分型困難、腫瘤部位難確定、不能連續切片和永久保存標本等局限性，一定程度上制約了細胞學的應用及發展。

以漿膜腔積液為例，由于傳統涂片法存在涂片厚、細胞重疊、結構不清、細胞量少、陽性檢出率低等缺點，診斷的靈敏度僅為50%～78%[3]，特別是對細胞形態不典型的間皮細胞、轉移癌細胞的鑒別僅用直接離心涂片法常難以鑒別。文獻報道，有高達12%的病例會遇到間皮細胞與癌細胞難以鑒別的狀況[4]。這種診斷的不明確甚至可以延誤治療。

2 細胞塊技術的原理與方法

細胞塊技術的基本原理是將樣品離心，細胞和微小組織塊被高度濃縮后固定，石蠟包埋后切片染色觀察[5]。細胞塊石蠟包埋切片收集到的有核細胞多、細胞結構清晰,與常規涂片法相結合,可以大大提高細胞學的陽性檢出率，對細胞量較少、診斷困難的標本意義更大。而且細胞塊通過石蠟包埋后類似組織塊，可以連續切片及永久性保存標本，彌補了傳統涂片的不足，更可以進行進一步的分子生物學檢測。

關于細胞塊技術的應用在文獻中可見零星報道，制備方式也各異，常用的有普通離心沉淀法和瓊脂凝聚法[6]，另有姚宇琪等[7]報道的試管包埋法及王永生等[5]報道的蛋清凝聚法，這幾種方法主要在保存細胞及固定支架上存在差異。關于細胞塊制備技術的關鍵是要盡量完整保存標本，在制備時盡量減少細胞收縮、能夠較好地脫水、透明、浸蠟。

2.1普通離心沉淀法 將樣本放在試管中離心后，去上清，用鑷子盡可能將底部的沉淀物取出，用拭鏡紙包好放入包埋盒中，置入10%中性甲醛溶液中固定2 h后常規脫水包埋。這種方法簡單易行，但是在收集沉淀物時會存在收集不全的情況。此外，對于一些細胞量少的標本無法制作成細胞塊。由于沉淀物中沒有固定支架，可能存在切片后脫片，染色困難的情況。

2.2試管包埋法 其是姚宇琪等[7]對普通離心沉淀法進行改良后發展出來的一種細胞塊制作技術。主要技術要點為將樣本在一次性塑料試管中離心后，去上清，用手術剪在距試管底部沉淀物上方0.1～0.2 cm處剪去上段試管,將裝有沉淀物的試管底端置入包埋盒中，在10%中性甲醛溶液中固定2 h后常規脫水包埋。這種方法簡單且收集的細胞信息全面，不存在細胞成分丟失的情況，但同樣由于沉淀物中沒有固定支架，可能存在切片后脫片，染色困難的情況。

2.3瓊脂凝聚法 這是細胞塊制作常用的一種方法[8]。技術要點為將樣本放在試管中離心后，去上清，在其中加入融化的瓊脂混勻后再次離心，取沉淀物用拭鏡紙包好后放置入包埋盒中，在10%中性甲醛溶液中固定2 h后常規脫水包埋。這種方法細胞丟失較少，但是瓊脂臨用前需要水浴加熱溶解后方可使用，且瓊脂不溶于乙醇、二甲苯，凝固后密度大、組織內外液體不易滲透、切片、染色效果欠佳。

2.4蛋清凝聚法 王永生等[5]報道，將樣本放在試管中離心后，去上清，在其中加入市售雞蛋清液或鵪鶉蛋清液混勻后再次稍離心，取沉淀物用拭鏡紙包好后置入包埋盒中，在10%中性甲醛溶液中固定2 h后常規脫水包埋。這種方法細胞丟失較少，雞蛋清作為一種高效價蛋白質,具有較強的滲透性,蛋清遇乙醇后可以凝固成塊狀(即蛋白支架),細胞被網絡其中,不易丟失,有利于取材和包埋。

2.5凝血酶血清凝聚法 將樣本放在試管中離心后，在其中加入凝血酶及人血清混勻后再次稍離心，取沉淀物用拭鏡紙包好后置入包埋盒中，在10%中性甲醛溶液中固定2 h后常規脫水包埋。這種方法細胞丟失較少，人血清遇乙醇后可以凝固成塊狀,細胞被網羅其中,不易丟失,有利于取材和包埋，且試劑來源方便。但是細胞成分依然會有一定丟失[9]。

3 細胞塊在脫落細胞學中的應用

細胞塊制成后可以連續切片，根據診斷及研究需要開展類似組織學的各種檢查[10]。

3.1HE染色 脫落細胞的性質有良惡性之分，通過傳統涂片有時是難以診斷的。在制成細胞塊后，其中往往有一些小的組織團塊，在HE染色中可以清晰地展現出其來源組織的結構。如腺癌可以觀察到腺體或乳頭狀結構。其形態學結構與組織學非常相似，對于診斷有極大幫助。

3.2免疫細胞化學 惡性腫瘤在組織形態上時常無法區分其來源和發生部位，尤其對于體質較差的患者進行手術局部取材往往具有較大的風險，患者也會承受較大的痛苦，造成患者治療上的困難。用細胞塊進行免疫細胞化學染色可連續切片,有利于多種抗體組合運用觀察,陽性顆粒為棕黃色,定位準確可靠、背景清晰、可重復性高,提高了疑難病例診斷的準確率[11]，對于尋找轉移腫瘤原發病灶其功效類似于免疫組織化學法。陳穎等[12]研究認為，D2-40、Calretinin等在惡性腹水中高表達；陳歷國等[13]和Stopyra等[14]研究認為，細胞角蛋白7、細胞角蛋白20鑒別轉移性腸癌引起的腹水具有高特異性及敏感性；智俐等[15]通過30例切片陽性的細胞塊標記抗體癌胚抗原、Calretinin檢測，認為將漿膜腔積液脫落細胞制備瓊脂細胞塊,選擇特異性抗體標記,對診斷及鑒別診斷有重要意義。但是，由于細胞塊本身是分散細胞的集合，對某一特定細胞的比較有時會較為困難。

3.3熒光原位雜交 該技術是利用已知核酸序列作為探針，以熒光素直接標記或先以非放射性物質標記后與靶 DNA進行雜交，再通過免疫細胞化學過程連接上熒光素標志物，最后在熒光顯微鏡下觀察雜交信號，從而對標本中待測核酸進行定性、定位和定量分析的方法[16]。乳腺癌組織中有無人表皮生產因子受體2基因擴增和蛋白過度表達,對于判斷患者的預后、預測臨床療效以及選擇使用赫賽汀生物靶向治療有重要意義,因此準確檢測人表皮生產因子受體2基因和蛋白狀況極為關鍵[17-18]。最近有研究表明[16，19],淋巴瘤患者存在基因和染色體變異,這些變異在淋巴瘤的發生、發展、預后評價等方面均有要意義。對于手術取材困難、一般情況差的患者，通過細針吸取細胞學采集的標本可以制作成細胞塊來進行熒光原位雜交檢測，從對腫瘤的影響及治療進行綜合判斷。

4 展 望

傳統涂片收集的細胞少而易出現假陰性，涂片厚薄不均而致陽性物質定位不清出現假陽性，更不能連續切片及永久性保留標本。細胞塊技術可彌補上述不足[20]，用細胞塊不但可以對微小組織進行組織學的HE形態觀察，還可以通過免疫細胞化學、原位雜交、熒光原位雜交等技術解決更多診斷和研究上的問題。細胞塊技術的應用一方面保證了診斷的準確性，減輕病理科醫師的診斷風險，另一方面對于臨床尋找原發病灶、對癥治療有重要的指導作用。

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