Nek2調節中心體異常及其與腫瘤關系的研究進展

許志陽(綜述)，周鳳麗(審校)

(中山大學附屬第三醫院呼吸內科，廣州 510630)

自從1992年Letwin等[1]發現never in mitosis A(NIMA)相關蛋白激酶1(NIMA-related kinase-1,Nek1)以來，對Nek家族的研究不斷深入，目前已經發現其家族有11個成員,而Nek2是其中一員。近年來發現其與中心體的關系密切，而且與多種腫瘤的發生、發展也有關聯，相關研究越來越多。

1 中心體的概述

1.1結構 典型的中心體是細胞內一個體積很小的無膜包被的細胞器，其在細胞核附近處直徑為100～200 nm，長200～500 nm，約占據1 μm3的體積。在高級哺乳動物細胞中，中心體即微管組織中心的細胞器外觀形態，由兩大部分結構組成，包括一對互相垂直的中心粒和包繞在中心粒周圍的外周基質。在電鏡下中心粒呈筒狀，由9組三聚體微管呈輻射對稱排列圍成。中心粒周圍外周基質存在著無線粒體的細胞器，是由一些中心體蛋白通過介導蛋白質相互交聯而形成的結構域。目前研究發現在細胞分裂間期只有一個中心體位于細胞核附近，而在進入有絲分裂期后將出現兩個中心體分別位于紡錘體兩極[2]。DNA復制和中心體復制同時在G1/S開始，均以半保留方式復制，而這種復制方式已經有研究發現在形態學上變化可大致分為4個過程：①中心體的解離；②中心體復制和延伸；③中心體的斷裂和新中心體的成熟；④成熟的新中心體分離[3]。

1.2功能 中心體在細胞有絲分裂間期及有絲分裂期，主要是作為微管組織中心從而發揮作用。具體主要表現在以下兩方面：①在有絲分裂間期調節細胞微管的數目、極性、穩定性以及在細胞內空間分布；②在分裂期中主要是形成兩極紡錘體并使其與染色體相連，在細胞有絲分裂過程中在微管的牽引下使兩對子染色體向細胞的兩極方向運動，從而準確保證復制后的兩對單倍染色體可以平均分配到2個子細胞中去，以便確保子代基因組的穩定；同時中心體在細胞器的定向運輸過程中為其提供可用的空間通道，并在細胞周期正常進行過程中參與調節染色體的正常運動。目前有研究發現,當細胞內的中心體受損時細胞在進行有絲分裂過程時，由于缺乏中心體使紡錘體精確定位出現異常而影響兩對子染色體向細胞兩極運動，從而導致細胞周期不能正常進行[4]。

1.3調控因素 中心體的精細調控可發生在細胞周期的每一個階段，但是目前具體調控中心體功能的因素和導致中心體異常的機制尚不明確，而已知的調控因素據目前研究主要與以下幾個方面有關：中心體相關的蛋白激酶；中心體的不對稱遺傳；有絲分裂過程中與蛋白酶降解途徑有關物質。目前已被研究認識的激酶有：Aurora蛋白激酶家族、細胞周期依賴激酶家族以及極樣激酶(polo like kinases，PLK)家族。而另外一種激酶NIMA家族，尤其是Nek2作為中心體的調控因素也越來越受到關注。

2 Nek2的定位、結構及功能

2.1Nek2定位 1975年，Morris[5]在研究絲狀真菌-曲霉菌的時候發現，細胞周期突變體其實質可以分為blocked in mitosis(bim)和never in mitosis(nim)兩類，其將bim解釋為有絲分裂的紡錘體和染色體發生聚集而阻礙了有絲分裂進行正常過程的突變體；nim解釋為停留于有絲分裂間期而不進入分裂期的突變體。后來經過大量的研究探索發現,nim突變體包含一個基因的4個等位基因，首次被命名為nimA。通過進一步研究也證實了nimA的作用主要是影響有絲分裂，通過調節有絲分裂的紡錘體極，而人類細胞的中心體地位相當于真菌有絲分裂中紡錘體極[6]。后來經過研究nimA被成功克隆出來并被證明其本質是一種編碼絲氨酸/蘇氨酸的激酶并被正式命為NIMA[7]。Letwin等[1]從小鼠中成功分離并克隆出第1個與NIMA相關的基因，后被命名為Nek1基因。有學者提出在高等哺乳動物中也可能存在1個在結構和功能上相對高度保守的Nek基因家族，可以認為Nek家族其實是NIMA基因家族在高等哺乳動物表達的延伸[1]。隨后在人類細胞中也分離出與Nek1相關的基因，從而證明在高等哺乳動物中Nek基因家族的確存在[7-8]。到目前為止已分離出的Nek家族有11個成員，即Nek1～Nek11，而Nek2與NIMA的同源性最高。Nek2在已復制的2個中心體的近端高度表達，但有研究發現約90% Nek2在未同步化的細胞中表達于中心體外，他們對此提出了兩種解釋：①中心體外和體上表達的Nek2維持一種動態平衡,而中心體承載量有限；②表達于中心體外的Nek2可能有其他方面的功能[9]。也有研究者觀察到3種Nek2的剪接異構體的亞細胞定位不同，即Nek2A表達于細胞質和細胞核，Nek2B主要是在細胞質中表達，而Nek2C主要表達于細胞核[10]。

2.2Nek2結構 經研究已經發現高等哺乳動物的Nek2的構成主要是一種具有445個氨基酸殘基序列的蛋白。與真菌的Nek2結構一樣，由一個激酶區域的N端和一個未催化的卷曲的螺旋區域的C端組成。N端區域是典型的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶的氨基酸序列,而C端區域有2個能夠形成卷曲螺旋體的位置，分別為緊靠激酶區域的下游和最末的C端[11]。目前已知人類細胞中Nek2表達Nek2A、Nek2B、Nek2C，三種結構相似的剪接異構體，重要的區別在于Nek2C具有強核定位信號，而Nek2A則較弱，Nek2B無此結構域。三者的C端區域區別在于Nek2B比Nek2A少31個卷曲螺旋結構，Nek2A比Nek2C多38個氨基酸序列[10]。

2.3Nek2的功能 Nek2在催化區域與NIMA有著高度相似性，不同的是Nek2并非細胞進入有絲分裂過程所必須的，在此過程中其主要作用是調節中心體分離[12]。Fry[9]發現哺乳動物的Nek2主要是調控中心體在G2～M期向兩極分離，而這對于形成雙極紡錘體和分離染色體具有重要的作用。其中Nek2和蛋白質磷酸酶(protein phosphatase1,PP)1的復合體是中心體黏附及分離的主要調節器之一，其可以確保G2期紡錘體順利進入M期。Nek2在細胞有絲分裂間期受PP1抑制，其活性較低，進入G2晚期PP1逐漸失活或移位致使Nek2抑制解除，活性增加從而促進中心體發生分離。調節過程中Nek2主要是通過磷酸化將2個未分離的中心體的2種蛋白連接，即將中心體相關蛋白1和小根蛋白連接致使其脫離中心體而發生分離。因此,Nek2的表達增加或活性升高，PP1、中心體相關蛋白1受抑制均促進中心體發生分離[10]。除了起到調節中心體作用外，Nek2還可促使染色質濃縮和中間體與著絲點上的組蛋白H3細胞發生分離，同時在染色體發生準確分離中起重要作用。Nek2發揮作用的關鍵是癌癥高表達蛋白發生磷酸化，而非磷酸化的癌癥高表達蛋白將干擾染色質濃縮，并可使微管與著絲粒的黏附發生廣泛出錯，它可以發生單極或多極黏附，故只有磷酸化的癌癥高表達蛋白才能確保染色體準確分離[13]。進一步研究Nek2在早期胚胎中的作用，證實了Nek2在調控細胞周期過程和中心體分離中的重要地位。有研究者通過在顯微鏡下注射微RNA抑制Nek2在小鼠胚胎細胞中的調節作用，結果使75%的胚胎不能進入胚泡期，大部分被逮捕在第四細胞期[14]。大多數胚胎的分裂球在形態學上呈現出不同程度的缺陷，形成了異常的片狀結構和無規律的核形態，其中包括啞鈴核、微核。Nek2是通過與中心體蛋白、Nek2作用蛋白(Nek2-interacting protein1，NIP1)/centrobin作用而參與微管的組裝過程，其表達受抑時可引起微管組裝發生障礙，進一步引起中心體發生成熟障礙。但是,Nek2能把胞質內的NIP1聚集物分解為許多小片段，抵抗NIP1的抑制從而使其與微管緊密結合以維持微管穩定[15]。

3 Nek2與腫瘤

3.1Nek2異常表達與腫瘤 有研究發現[16]，異常表達的Nek2可結合并進一步磷酸化Mad2及Cdc20，以致于干擾它們作為有絲分裂過程中檢查點的相關作用，從而引起宿主染色體的不穩定性最終可導致腫瘤的發生。Quarmby等[17]認為，有活性的Nek2A過度表達會導致不成熟的中心體提前分離，而無活性的Nek2A過度表達將會形成異常中心體包括單極紡錘體和非整數倍體，他們認為腫瘤發生與這些異常的中心體出現均相關。Osmani等[18]認為,當Nek2及其同系物過度表達可以使中心體聚集從而加快有絲分裂進程，甚至可以直接引起染色體的分裂，并且證明當Nek2出現過表達可以產生額外的中心體，從而形成多核細胞的增殖；還有學者提出Nek2的異常表達可以影響染色體著絲點蛋白[19]。目前有研究也發現[20]，在人類睪丸精原細胞瘤中Nek2基因水平的表達顯著上調。也有研究表明，Nek2在乳腺原位癌及乳腺浸潤性癌的表達均顯著高于正常的乳腺組織，而在乳腺浸潤性癌中的表達又顯著高于乳腺原位癌，這兩者之間均有統計學意義[21]。同樣Kokuryo等[22]研究也發現，人膽管癌細胞所表達的Nek2的mRNA和蛋白水平都較正常成纖維細胞有明顯增加。最近梁基韻等[23]運用免疫組織化學法，利用組織芯片技術，發現在消化系統腫瘤組織中Nek2的表達同樣明顯增高。

3.2Nek2促進腫瘤發生 非整倍體及染色體缺乏穩定性是腫瘤細胞所具有的最常見的兩大特征，其通常由在有絲分裂過程中細胞分裂或染色體分離異常所引起的。而Nek2不僅參與中心體分離,而且還參與染色質濃縮和染色體分離，因此Nek2既可間接調節中心體也可直接干擾染色體而影響整個有絲分裂過程的穩定，從而促使細胞向惡性增生方向轉化[20]。Nek2表達水平及活性增高是其在腫瘤細胞中最普遍的表現形式。

3.3Nek2與腫瘤化療的敏感性 化療是治療腫瘤的一種普遍方式之一，化療對一些實體腫瘤有高度的特異性。有針對性地增加腫瘤細胞的敏感性是目前化療藥物的重要機制。調節Nek2的表達水平可能增加化療的耐藥性。Lee等[24]發現,聯合Nek2小分子干擾RNA可以提高化療藥物在乳腺癌的敏感性。

3.4Nek2作為治療腫瘤的靶點 現在在一些人類癌癥中發現Nek2表達水平的增高，提高了Nek2作為潛在的癌癥治療靶點的地位。但是,在發現治療藥物之前確認是否Nek2可以成為一個有效的治療靶點。有一種確認方法是檢查阻遏蛋白在細胞模型中的表達。Kokuryo等[22]在向膽管上皮癌裸鼠模型的腫瘤周圍注射Nek2-小分子干擾RNA時首先發現可干擾Nek2表達，不僅顯著抑制膽管上皮癌細胞增殖而且延長有腹膜轉移的小鼠存活中位期。Tsunoda等[21]在乳腺癌裸鼠模型上發現用小分子干擾RNA干擾Nek2表達不僅可以顯著降低乳腺癌細胞增殖,而且還大大降低了乳腺癌向體外浸潤的風險。另外,在結直腸癌細胞模型以及組織活檢中發現用小分子干擾RNA干擾Nek2可抑制腫瘤的生長[25]。所以,抑制Nek2的過表達就有可能抑制腫瘤的發生和發展，可能作為治療腫瘤的一種新方法，而且目前在這方面的研究也是熱點。

4 展 望

從癌癥生物學的角度來看，目前在多種腫瘤的不同類型中均發現Nek2過度表達的現象，表明其可作為選擇性干擾癌細胞擴散以及重要的預后標志物。但是,對于Nek2結構的進一步明確，了解其激活機制從而設計特異性的抑制劑仍較困難。隨著研究的不斷深入也越來越發現，Nek2在腫瘤中表達水平的升高有可能是因為基因的擴增失去控制導致的。這樣就為治療腫瘤提供了一種新的思路，即控制Nek2的過表達，這也給那些難治的癌癥患者帶來了希望。Nek2能否作為新的腫瘤標志物，其與腫瘤的發生、發展、預后及耐藥的關系，抑制Nek2的過表達能否真正達到治療腫瘤的目的以及怎樣抑制其過表達，仍將有一段很長的路要走。

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