層流切應力通過miRNAs抑制內皮細胞增殖

陳國軍(綜述)，胡雪松(審校)

(廣東醫(yī)學院附屬深圳福田區(qū)人民醫(yī)院心內科,廣東 深圳 518000)

血管剪切應力是由于血管內血液流動產生的摩擦力，為機械力，其通過轉換成細胞內信號而影響內皮細胞病理生理功能。微RNA(microRNA，miRNA)廣泛參與調控內皮細胞的基因表達。目前認為層流剪切應力可通過減少血管內皮細胞炎癥發(fā)生、抑制其增殖、內皮細胞血管新生及炎癥反映發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用,而這一作用通過誘導miRNA表達并作用目的蛋白實現[1-4]。該文就近年來層流剪切力調控內皮細胞的形態(tài)、結構、功能等研究進展予以綜述。

1 層流切應力調控內皮細胞功能機制

目前層流切應力對內皮細胞功能影響的具體機制仍然需要進一步闡明。目前研究認為,層流剪切應力可通過調節(jié)基因的表達而調節(jié)內皮細胞生物學功能[5]。在轉錄水平分子機制上，血流產生剪切應力引起基因表達的改變已經得到廣泛的研究并證實，國內外學者的研究表明，在血管層流剪切應力作用下，如核因子κB、轉錄因子kruppel-like factor 2(KLF2)、去乙酰化酶等轉錄因子被發(fā)現起著傳遞誘導內皮細胞基因表達作用，從而參與內皮細胞各項功能的調節(jié)[6-8]。最近不少國內外學者開始重視轉錄后水平研究切應力對內皮細胞功能調控的機制。miRNA是一系列高度保守非編碼家族性RNA(長度多位19～22個核苷酸)，可在基因轉錄后水平調節(jié)目標信使RNA(mRNA)基因表達或促進其功能衰退，從而調控血管內皮細胞功能[9-10]。目前研究發(fā)現，層流剪切應力通過miRNA在轉錄后調節(jié)內皮細胞內目標基因表達而發(fā)揮作用，miRNA在層流剪切應力對血管內皮細胞功能調節(jié)上起著關鍵傳遞作用[11-13]。miRNA是一類家族性基因，具有許多表型，不同種類在內皮細胞中起著不同作用，在層流剪切應力影響下，部分miRNA表達上調，而一部分會產生表達抑制[14-16]，正是通過miRNA與目標mRNA的結合影響內皮細胞基因表達發(fā)揮調控作用，目前已發(fā)現miRNA參與血管內皮細胞衰老、增殖及炎性反應等多方面的調控，在血管性疾病的發(fā)生、發(fā)展中起著關鍵作用[17-18]。

2 miRNA的基本特征

miRNA是一個家族性的RNA(20～26個核苷酸的長度)，可調節(jié)真核生物中的基因表達，最早于線蟲中發(fā)現，并發(fā)現廣泛存在于真核生物細胞內。目前為止在人類發(fā)現約有700多個基因組，其中20%～30%參與蛋白質翻譯的調節(jié)，miRNA通過沉默基因表達而抑制蛋白質的翻譯，或通過加速mRNA功能減退，發(fā)揮了各種病理生理作用，包括細胞增殖、分化、凋亡、代謝及血管新生等[19-21]。此外，miRNA在某些疾病當中具有高度的組織特異性，可作為疾病診斷的特異標志物，用于疾病的診療。miRNA是由RNA聚合酶Ⅱ催化轉錄而成，在細胞核內經Drosha和DGCR8/Pasha加工修飾成為前體miRNA(pre-miRNA)，前體miRNA為60～70個核苷酸長，經特殊蛋白轉運至胞質中(主要的miRNA)，在胞質中由Dicer酶或在胞核被CAF(Dicer酶的同族物)剪切、修飾加工成熟，形成20～26個核苷酸長度的成熟miRNA[22-24]。

3 剪切力對血管內皮細胞基因表達調控的影響

Wang等[25]認為，血管層流切應力對內皮細胞具有保護作用，層流切應力可通過調節(jié)內皮細胞基因的表達，參與調節(jié)血管張力、誘導血栓形成、控制細胞生命周期以及血管炎性反應等，起到減少內皮細胞炎癥發(fā)生及抑制其增殖的作用。他們利用DNA基因芯片技術檢測內皮細胞DNA發(fā)現，將內皮細胞暴露在15×10-5N/cm2的層流切應力作用24 h后，大約有3%左右的基因表達增加一倍以上或顯著下降，其中表達上調的基因主要參與抗氧化、抗內皮細胞增殖、減少細胞炎性反應，而表達下調基因主要與DNA合成及細胞生命周期有關，這表明層流切應力具有調控內皮細胞基因表達發(fā)揮保護內皮細胞作用。同樣，Weber等[26]也利用基因技術，在一些剪切力反應基因的啟動子上游序列中確定了一種應力響應元件。有研究發(fā)現，響應元件與血管內皮細胞DNA特異性結合，可使基因產物上調或下調，這類基因包括：一氧化氮合酶、內皮素1、原癌基因c-Fos、c-Jun、轉化生長因子β和單細胞趨化蛋白1等[27]。層流切應力對miRNA表達的影響由Ni等[28]比較了內皮細胞在有無層流剪切壓力(12×10-5N/cm2)miRNA的表達，發(fā)現層流處理約12 h的內皮細胞在芯片上的569個miRNA中，有35個miRNA顯著上調，而26個顯著下調[27-28]。miR-19A就是其中一個經切應力處理出現顯著下調的基因型，它在靜止狀態(tài)下高度表達，而經剪應力處理后，表達水平顯著下降。進一步檢測目的蛋白的研究發(fā)現穩(wěn)定過表達miR-19A，可顯著減低目標蛋白cyclinD1的水平，使細胞周期停滯在G1/S期，抑制內皮細胞的增殖。反之miR-19a被抑制后，內皮細胞增殖顯著增加，由此證實層流剪應力通過調節(jié)miRNA的表達，發(fā)揮抑制內皮細胞增殖的作用[29]。

4 miRNA對內皮細胞的作用

miRNA是一個家族的高度保守的非編碼單鏈RNA，可在轉錄水平調控基因表達而發(fā)揮作用。目前超過700個miRNA在人類基因組已經確定，其中20%～30%調節(jié)人體的蛋白質編碼基因而發(fā)揮病理生理作用[30]。目前認為miRNA對血管內皮細胞的調節(jié)作用是在細胞衰老、血管生成和血管炎癥等方面發(fā)揮作用。其中miR-34A、miR-217、miR-200、miR-146C和miR-181A等基因型參與調節(jié)細胞應激和增殖；miR-130A、miR-210、miR-424、miR-17-92、miR-27-B、miR-217基因型參與促血管生成； miR-221和miR-222具有抗血管生成的屬性；而miR-31、miR17-3β、miR-155、miR-221、miR-222、miR-126等基因型則參與調控血管炎癥的發(fā)生、發(fā)展[30-31]。血管內皮細胞功能與心血管疾病關系密切，而miRNA則參與血管內皮細胞的功能調節(jié)，因此認為miRNA的表達分析對心血管疾病的早期診斷及治療意義重大。

5 層流切應力抑制內皮細胞增殖機制

Ju等[32]在剪切應力調控內皮細胞增殖的機制研究中，認為血管層流剪切應力可誘導內皮細胞特定基因表達發(fā)揮調控作用，其中穩(wěn)定的層流剪切應力可抑制內皮細胞增殖、血管新生及減少炎癥反應，從而起到抗動脈粥樣硬化的作用。他們對層流剪切應力調控血管內皮細胞增殖的機制進行了深入研究，研究表明層流剪切應力通過誘導miR-19a表達上調，miR-19a通過與cyclinD1基因3′-非翻譯區(qū)結合，抑制cyclinD1基因表達，減低蛋白cyclinD1在內皮細胞內含量而發(fā)揮作用，而cyclinD1在細胞周期中具有促進G1/S細胞周期進展的功能，抑制了cyclinD1可導致內皮細胞停留在G0/G1細胞周期。歸納可得層流剪切應力可通過miR-19a作為傳遞載體，通過抑制目標cyclinD1基因表達，減少cyclinD1從而阻礙內皮細胞增殖進程而發(fā)揮抑制內皮細胞增殖作用[33]。

Urbich等[33]也對層流剪切應力調控內皮細胞增殖的機制進行了研究，他們的研究表明層流剪切應力可引起miR-101表達上調，并可與雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)3′-非翻譯區(qū)結合，抑制mTOR基因表達，減低蛋白mTOR在內皮細胞內含量而發(fā)揮作用，而mTOR與cyclinD1一樣，使內皮細胞停留在G0/G1細胞周期。

層流剪切應力可通過miR-101a作為傳遞載體，通過抑制目標mTOR基因表達，減少蛋白mTOR表達，阻礙內皮細胞細胞周期進程，抑制內皮細胞增殖作用。他們的研究進一步補充了層流剪切應力通過誘導miRNA表達，調控內皮細胞功能的具體機制[34]。

Doebele等[34]學者在血管生長因子對血管形成機制的研究中表明，血管生長因子可通過下調miR-101發(fā)揮促進血管形成作用，miRNA可直接作用于組蛋白甲基轉移酶(enhancer of zeste homolog 2，EZH2)發(fā)揮作用，miRNA表達上調可抑制EZH2下調發(fā)揮作用，相反抑制miRNA可引起EZH2的表達增加，引起血管內皮細胞增殖從而促使血管生成。Zhou等[35]在對miR-101調控前列腺癌內皮細胞功能的研究中，發(fā)現人為使miR-101的表達上調，可使目的基因EZH2表達下調，發(fā)揮抑制腫瘤細胞增殖作用，從而起到抗腫瘤細胞生長，延緩腫瘤進程的積極保護作用[36]。

6 展 望

血流切應力通過miRNA調控目標mRNA表達發(fā)揮作用，最終發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用，血流切應力可通過調控miRNA的表達實現對內皮細胞功能的調節(jié)，因此進一步了解層流切應力調控內皮細胞的形態(tài)、功能及與動脈血管損傷等作用機制，對從分子水平探索預防和治療心血管疾病具有重要意義。目前切應力通過miRNA影響內皮細胞功能的部分靶標已得到證實，但是miRNA對內皮細胞功能調控的機制仍有待進一步完善，值得進一步探討。

[1] Chien S.Mechanotransduction and endothelial cell homeostasis:the wisdom of the cell[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2007,292(3):H1209-H1224.

[2] Chiu JJ,Chen LJ,Chen CN,etal.A model for studying the effect of shear stress on interactions between vascular endothelial cells and smooth muscle cells[J].J Biomech,2004,37(4):531-539.

[3] Hashimoto-Komatsu A,Hirase T,Asaka M,etal.AngiotensinⅡinduces microtubule reorganization mediated by a deacetylaseSIRT2 in endothelial cells[J].Hypertens Res,2011,34(8):949-956.

[4] Lu D,Kassab GS.Role of shear stress and stretch in vascular mechanobiology[J].J R Soc Interface,2011,8(63):1379-1385.

[5] Thum T.MicroRNA therapeutics in cardiovascular medicine[J].EMBO Mol Med,2012,4(3):1214-1216.

[6] Carthew RW,Sontheimer EJ.Origins and mechanisms of miRNAs and siRNAs[J].Cell,2009,136(4):642-655.

[7] Kim VN,Han J,Siomi MC.Biogenesis of small RNAs in animals[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2009,10(2):126-139.

[8] Lewis BP,Burge CB,Bartel DP.Conserved seed pairing,often flanked by adenosines,indicates that thousands of human genes are microRNA targets[J].Cell,2005,120(1):15-20.

[9] Lewis BP,Shih IH,Jones-Rhoades MW,etal.Prediction of mammalian microRNA targets[J].Cell,2003,115(7):787-798.

[10] Stark A,Brennecke J,Bushati N,etal.Animal microRNAs confer robustness to gene expression and have a significant impact on 3′UTR evolution[J].Cell,2005,12(6):1133-1146.

[11] Xie X,Lu J,Kulbokas EJ,etal.Systematic discovery of regulatory motifs in human promoters and 3′ UTRs by comparison of several mammals[J].Nature,2005,434(7031)：338-345.

[12] Farh KK,Grimson A,Jan C,etal.The widespread impact of mammalian MicroRNAs on mRNA repression and evolution[J].Science,2005,10(5755):1817-1821.

[13] Malek AM,Izumo S.Control of endothelial cell gene expression by flow[J].J Biomech,1995,28(12):1515-1528.

[14] Fisslthaler B,Boengler K,Fleming I,etal.Identification of a cis-element regulating transcriptional activity in response to fluid shear stress in bovine aortic endothelial cells[J].Endothelium,2003,10(4/5):267-275.

[15] Bonauer A,Carmona G,Iwasaki M,etal.MicroRNA-92a controls angiogenesis and functional recovery of ischemic tissues in mice[J].Science,2009,324(5935):1710-1713.

[16] Hergenreider E,Heydt S,Tréguer K,etal.Atheroprotective communication between endothelial cells and smooth muscle cells through miRNAs[J].Nat Cell Biol,2012,14(3):249-256.

[17] Maroski J,Vorderwülbecke BJ,Fiedorowicz K,etal.Shearstress increases endothelial hyaluronan synthase 2 and hyaluronan synthesis especially in regard to an atheroprotective flow profile[J].Exp Physiol,2011,96(9):977-986.

[18] Tranb O,Bcrk BC.Laminar shear stress:mechanisms by which endothelial cells transduce all atheroprotective force[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,1998,18(5):677-685.

[19] Uzoigwe C.The human erythrocyte has developed the biconcave disc shape to optimise the flow properties of the blood in the large vessels[J].Med Hypotheses,2006,67(5):1159-1163.

[20] Hladunewich M,Karumanchi SA,Lafayette R.Pathophysiology of the clinical manifestations of preeclampsia[J].Clin J Am Soc Nephrol,2007,2(3):543-549.

[21] Small EM,Frost RJ,Olson EN.MicroRNAs add a new dimension to cardiovascular disease[J].Circulation,2010,121(8):1022-1032.

[22] Garcia-Cardea G,Comander J,Anderson KR,etal.Biomechanical activation of vascular endothelium as a determinant of its functional phenotype[J].Proc Natl Acad Sci USA,2001,98(8):4478-4485.

[23] Dekker RJ,van Soest S,Fontijn RD,etal.Prolonged fluid shear stress induces a distinct set of endothelial cell genes,most specifically lung Krüppel-like factor(KLF2)[J].Blood,2002,100(5):1689-1698.

[24] Qin X,Wang X,Wang Y,etal.MicroRNA-19a mediates the suppressive effect of laminar flow on cyclin D1 expression in human umbilical vein endothelial cells[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2010,107(7):3240-3244.

[25] Wang KC,Garmire LX,Young A,etal.Role of microRNA-23b in flow-regulation of Rb phosphorylation and endothelial cell growth[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2010,107(7):3234-3239.

[26] Weber M,Malek,Moore JP,etal.Laminar Shear Stress(Lss) is induced in endothelial cells by shear stress and modulates apoptosis and eNOS activity[J].Biochem Biophys Res Commun,2010,393(4):643-648.

[27] Holliday CJ,Ankeny RF,Jo H,etal.Discovery of shear-and side-specific mRNAs and miRNAs in human aortic valvular endothelial cells[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2011,301(3):H856-867.

[28] Ni CW,Qiu H,Jo H.MicroRNA-663 upregulated by oscillatory shear stress plays a role in inflammatory response of endothelial cells[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2011,300(5):h1762-1769.

[29] Fang Y,Shi C,Manduchi E,etal.MicroRNA-10a regulation of proinflammatory phenotype in athero-susceptible endothelium in vivo and in vitro[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2010,107(30):13450-13455.

[30] Wu W,Xiao H,Laguna-Fernandez A,etal.Flow-dependent regulation of Kruppel-Like factor 2 is mediated by microRNA-92a[J].Circulation,2011,124(5):633-641.

[31] Fang Y,Davies PF.Site-specific microRNA-92a regulation of Kruppel-like factors4 and 2 in atherosusceptible endothelium[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2012,32(4):979-987.

[32] Ju H,Kokubu H,Todd TW,etal.Polyglutamine disease toxicity is regulated by Nemo-like kinase in spinocerebellar ataxia type 1[J].J Neurosci,2013,33(22):9328-9336.

[33] Urbich C,Dernbach E,Reissner A,etal.Shear stress-induced endothelial cell migration involves integrin signaling via the fibronectin receptor subunits alpha(5) and beta(1)[J].Arterioscler Thromb Vasc Biol,2002,22(1):69-75.

[34] Doebele C,Bonauer A,Fischer A,etal.Members of the microRNA-17-92 cluster exhibit a cell-intrinsic antiangiogenic function in endothelial cells[J].Blood,2010,115(23):4944-4950.

[35] Zhou Q,Gallagher R,Ufret-Vincenty R,etal.Regulation of angiogenesis and choroidal neovascularization by members of microRNA-23 clusters[J].Proc Natl Acad Sci U S A,2011,108(20):8287-8292.

[36] Urbich C,Kaluza D,Fromel T,etal.MicroRNA-27a/b controls endothelial cell repulsion and angiogenesis by targeting semaphorin 6A[J].Blood,2012,119(6):1607-1616.