泛素折疊修飾因子1作用的研究進展

沈瓊娜(綜述)，胡小磊，陳鳳玲※(審校)

(1.蚌埠醫學院，安徽 蚌埠 233000； 2.上海交通大學醫學院附屬第三人民醫院內分泌科，上海 201900)

泛素折疊修飾因子1(ubiquitin fold modifier 1，Ufm1)是由Komatsu等于2004年首先在HEK293細胞中發現的一種小分子類泛素蛋白，其分子質量為9.1×103[1]。Ufm1及其修飾系統廣泛地、保守地存在于動、植物中，如小鼠的腦、心、肺、腎、肝、腹腔固有巨噬細胞等組織[2]。Ufm1以前體形式存在，需經特異性蛋白酶進行加工處理，再經過一系列酶級聯反應，才能與靶蛋白結合，發揮生物學作用。

1 Ufm1的結構

Ufm1是一類小分子類泛素蛋白，由85個氨基酸組成。Ufm1和泛素及其他類泛素蛋白的氨基酸序列比較，其C端有一個絲-甘氨酸二肽結構，而泛素及其他類泛素蛋白在C端有一個保守的雙甘氨酸序列[1，3]。正因為其C端區域的不同導致了空間構向的多變性，提示Ufm1可能發揮多樣的生物學作用。

Ufm1及其修飾系統在動植物體內表達豐富，尤其在分泌蛋白的細胞中表達豐富，如胰腺腺泡、胰島的朗格漢斯細胞和唾液腺等，其主要分布在細胞質和細胞核[2]。

2 Ufm1的修飾系統

2.1Ufm1特異性蛋白酶 Ufm1以前體形式廣泛存在于鼠和人的組織中，其氨基酸序列的C端有一個絲-甘氨酸二肽形式，絲氨酸需經過特異性蛋白酶進行加工處理暴露出甘氨酸殘基，才能與靶蛋白結合并對其進行修飾，發揮生物學功能[3]。Ufm1特異性蛋白酶1和Ufm1特異性蛋白酶2是目前發現Ufm1的兩個特異性剪切酶，可以對Ufm1 C端進行加工處理，暴露出甘氨酸殘基，但不能加工處理泛素和其他類泛素蛋白，比如小泛素樣修飾蛋白1和干擾素刺激基因15[3-6]。說明它們對Ufm1加工處理具有特異性，對研究Ufm1的功能具有重要的作用。

2.2Ufm1酶級聯反應 Ufm1作為一種新的類泛素蛋白修飾因子，有以下幾個依據：①與泛素三級結構類似，分子質量較??；②Ufm1是由前體進過加工處理形成；③C端的剪切和甘氨酸的暴露對Ufm1和靶蛋白結合是必需的；④Ufm1有激活酶、結合酶。類泛素蛋白在結構和蛋白結合途徑上與泛素十分相似。泛素和靶蛋白結合，并將靶蛋白轉移給溶酶體，使其降解，這一泛素介導的溶酶體蛋白降解途徑廣泛地存在于生物體中。但是,類泛素蛋白和靶蛋白結合后并不介導其通過溶酶體進行降解，而是對靶蛋白進行加工、修飾，使其發揮重要的生物學作用，這與泛素是不同的[4]。

Ufm1結合到靶蛋白也需要通過一系列的酶級聯反應，這和泛素及其他類泛素蛋白激活和結合靶蛋白的過程是類似的[1，7]。首先Ufm1是以前體形式存在于組織中，需經特異性蛋白酶進行加工處理，才能和靶蛋白結合。處理過的Ufm1首先被Uba5激活，然后轉移給Ufc1，再被轉移給Ufl1，Ufl1可識別靶蛋白并幫助Ufm1與靶蛋白結合，最后Ufm1對其進行加工修飾，使其發揮重要的生物學功能[1，3，8-9]。目前發現的靶蛋白有C20orf116[9]、CDK5RAP3/LZAP[2]、X盒結合蛋白1(X-box binding protein 1,Xbp1)[10]、微粒體三酰甘油轉運蛋白[11]，但其生物學功能大多是未知的，有待進一步深入探索。

3 Ufm1的作用

3.1內質網應激 內質網主要負責蛋白質折疊、加工、轉運和鈣調節等，內質網的平衡對正常細胞功能是十分重要的，這種平衡被打破會引起內質網應激和未折疊蛋白反應，產生多種功能變化[12-13]。

Azfer等[15]在患有缺血性心臟病的轉基因小鼠的心臟組織中發現內質網應激相關基因被激活，例如內質網氧化還原酶1、葡萄糖調節蛋白78、葡萄糖調節蛋白94、C/EBP同源蛋白、活化轉錄因子6等。同時發現在小鼠的心臟組織中Ufm1的表達量顯著上調，提示內質網應激與Ufm1之間可能存在某種關聯性。

近年來的研究也發現，在INS-IE細胞中，用內質網應激化學誘導劑環匹阿尼酸或毒胡蘿卜素誘導細胞產生內質網應激的同時，Ufm1及Ufl1表達量顯著上調；而經非內質網應激誘導劑環已酰胺和過氧化氫處理使Ufm1和Ufl1的表達水平沒有受到影響[2]。此研究說明內質網應激參與了Ufm1表達水平的調控。在另外兩種腫瘤細胞(HepG2和HCT116)中也有同樣的發現，在給予毒胡蘿卜素或衣霉素誘導細胞產生內質網應激后，Ufm1的表達水平增加；在囊泡轉運被抑制時，Ufm1修飾系統轉錄水平表達也增加；但是在U2OS細胞中沉默Ufm1增強了內質網應激反應[10]。上述的研究都證明了內質網應激可增加Ufm1的表達，同時Ufm1又可維持內質網的平衡，因此可確定Ufm1修飾系統和內質網之間存在重要的聯系。研究發現,在糖尿病模型鼠db/db小鼠腹腔固有巨噬細胞中內質網相關分子葡萄糖調節蛋白78、C/EBP同源蛋白、Xbp1表達水平顯著高于對照組，同時Ufm1表達水平也顯著升高[16]。經毒胡蘿卜素或衣霉素誘導小鼠單核巨噬細胞系Raw264.7細胞產生內質網應激時Ufm1的表達量也顯著增加[16]。上述研究提示,Ufm1可能部分通過內質網應激途徑影響巨噬細胞功能，從而參與疾病的發生、發展。

3.2細胞生物學作用 在INS-IE細胞中沉默Ufm1后，內質網應激的標志物葡萄糖調節蛋白78、C/EBP同源蛋白、Xbp1的表達水平沒有受到顯著影響，其凋亡也沒有受到影響；但在INS-IE細胞中沉默Ufm1后，再用內質網應激誘導劑如環匹阿尼酸、棕櫚酸酯、布雷菲爾德菌素A誘導細胞產生內質網應激，發現內質網應激誘導的凋亡顯著增加；而對放線菌酮和過氧化氫引起的非內質網應激誘導的凋亡沒有影響[2]。同時發現在沉默Ufm1的細胞中，胱天蛋白酶3的活性增強[2]。這些結果證明了Ufm1緩解了內質網應激誘導的胰島β細胞的凋亡，并對胰島β細胞產生保護作用。

另有研究發現，毒胡蘿卜素或衣霉素可誘導過表達Ufm1的巨噬細胞產生內質網應激，使巨噬細胞發生凋亡，與對照組相比過表達Ufm1的巨噬細胞由內質網應激誘導的凋亡顯著減輕，這也表明Ufm1緩解了內質網應激引起的巨噬細胞的凋亡[17]。因此,可以確定Ufm1與內質網應激存在聯系，并在內質網應激誘導的凋亡中發揮重要的作用。

近期有研究證實，Ufm1與細胞周期之間存在重要聯系。在Ufm1敲除的利什曼原蟲，用細胞周期分析發現細胞從G2～M到G1期發生阻滯，使細胞主要停留在G2～M期，利什曼原蟲在體外和寄生于人巨噬細胞中的存活減少。重新表達UFM1及其修飾系統后，利什曼原蟲的存活增加[11，18]。提示,Ufm1及其修飾系統在利什曼原蟲的存活和細胞周期等過程中發揮重要作用。

Uba5是新證明的Ufm1特異性激活酶。有研究發現在小鼠中敲除Uba5基因后，小鼠出現嚴重的貧血，隨即在胚胎中死亡。用轉基因的方法在小鼠中重新表達Uba5后，嚴重的貧血被恢復，并延長了小鼠的存活時間[19]。該研究證明,Ufm1特異性激活酶Uba5在紅細胞發育過程中發揮重要的作用，缺少該基因會使正常骨髓來源的巨核細胞系和紅細胞系前體細胞的發育受損。這證實了Ufm1修飾系統參與了造血系統的調控，參與調控紅細胞發育和促存活等生物學過程。

3.3其他作用 Gannavaram等[18]在利什曼原蟲中發現,Ufm1及其修飾系統的存在，并用免疫共沉淀技術證明Ufm1和微粒體三酰甘油轉運蛋白結合，催化脂肪酸β氧化。在Ufm1敲除的利什曼原蟲中，微粒體三酰甘油轉運蛋白不能與Ufm1結合，導致脂肪酸β氧化降低其產物乙酰輔酶A減少。重新表達Ufm1及其修飾系統后，脂肪酸β氧化被恢復。由此可以證明Ufm1及其修飾系統在脂肪酸β氧化中發揮重要作用。

既往有研究發現，冬眠是一種天然的缺氧耐受模型，在松鼠的冬眠過程中有大量的類泛素樣蛋白修飾過程發生。在冬眠松鼠的腦部組織中Ufm1表達量顯著增加[20]。提示類泛素蛋白包括Ufm1在應激反應中特別是在缺氧耐受過程中發揮多種重要功能，為研究其在缺氧耐受中的作用提供依據。

利用在線工具cisRED分析得出，Ufm1的啟動子包括很多順式作用元件，是E2F-1、AP-2、HIF-1等轉錄因子的結合位點[21]。Ufm1基因序列中包括了Xbp-1的結合位點，Xbp-1是未折疊蛋白反應中重要的轉錄因子[22]。在最近的研究中，利用熒光素酶報告分析、CHIP分析和基因沉默的方法證實了Ufm1是Xbp-1重要的生物學靶點，同時證實Ufm1修飾系統在未折疊蛋白反應中發揮重要影響[10]。

4 結 語

Ufm1是一種小分子類泛素蛋白，其與泛素三級結構十分類似，但生物學作用卻不相同。Ufm1及其修飾系統在多細胞生物體內穩定表達，含量豐富，提示其在生物體內的重要作用。Ufm1及其修飾系統參與了多種病理生理過程，例如內質網應激，并對內質網應激誘導的凋亡起到保護和緩解作用，同時也參與了細胞周期、細胞存活、缺氧耐受、脂肪酸β氧化等生物過程，但具體機制尚未知曉，有待于進一步研究探索。

[1] Komatsu M,Chiba T,Tatsumi K,etal.A novel protein-conjugating system for Ufm1,a ubiquitin-fold modifier[J].EMBO J,2004,23(9)：1977-1986.

[2] Lemaire K,Moura RF,Granvik M,etal.Ubiquitin fold modifier 1 (UFM1) and its target UFBP1 protect pancreatic beta cells from ER stress-induced apoptosis[J].PLoS One，2011，6(4):e18517.

[3] Sasakawa H,Sakata E,Yamaguchi Y,etal.Solution structure and dynamics of Ufm1,a ubiquitin-fold modifier 1[J].Biochem Biophys Res Commun,2006,343(1):21-26.

[4] Kang SH,Kim GR,Seong M,etal.Two novel ubiquitin-fold modifier 1 (Ufm1)-specific proteases,UfSP1 and UfSP2[J].J Biol Chem,2007,282,(8):5256-5262.

[5] Ha BH,Ahn HC,Kang SH,etal.Structural rasis for Ufm1 processing by UfSP1[J].J Biol Chem,2008,283(21):14893-14900.

[6] Ha BH,Jeon YJ,Shin SC,etal.Structure of ubiquitin-fold modifier 1-specific protease UfSP2[J].J Biol Chem,2011,286(12):10248-10257.

[7] Watson IR,Irwin MS,Ohh M.NEDD8 pathways in cancer,sine quibus non[J].Cancer Cell,2011,19(2):168-176.

[8] Mizushima T,Tatsumi K,Ozaki Y,etal.Crystal structure of Ufc1,the Ufm1-conjugating enzyme[J].Biochem Biophys Res Commun,2007,362(4):1079-1084.

[9] Tatsumi K,Sou YS,Tada N,etal.A novel type of E3 ligase for the Ufm1 conjugation system[J].J Biol Chem,2010,285(8):5417-5427.

[10] Zhang Y,Zhang M,Wu J,etal.Transcriptional-regulation of the Ufm1 conjugation system in response to disturbance of the endoplasmic reticulum homeostasis and inhibition of vesicle trafficking[J].PLoS One,2012,7(11):e48587.

[11] Gannavaram S,Connelly PS,Daniels MP,etal.Deletion of mitochondrial associated ubiquitin fold modifier protein Ufm1 in Leishmania Donovani results in loss of b-oxidation of fatty acids and blocks cell division in the amastigote stage[J].Mol Microbiol,2012,86(1):187-198.

[12] Wroblewski D,Jiang CC,Croft A,etal.Selective modulation of endoplasmic reticulum stress markers in prostate cancer cells by a standardized mangosteen fruit extract[J].PLoS One,2013,8(12):e84073.

[13] Tabas I.The role of endoplasmic reticulum stress in the progression of atherosclerosis[J].Circ Res,2010,107(7):839-850.

[15] Azfer A,Niu J,Rogers LM,etal.Activation of endoplasmic reticulum stress response during the development of ischemic heart disease[J].Am J Physiol Heart Circ Physiol,2006,291(3):h1411-h1420.

[16] 劉卉芳，張惠潔，劉曉燕,等.內質網應激對巨噬細胞類泛素折疊修飾蛋白Ufm1表達的影響[J].上海交通大學學報:醫學版，2012，32(3)：252-255.

[17] Hu X,Pang Q,Shen Q,etal.Ubiquitin-fold modifier 1 inhibits apoptosis by suppressing the endoplasmic reticulum stress response in Raw264.7 cells[J].Int J Mol Med,2014,33(6):1539-1546.

[18] Gannavaram S,Sharma P,Duncan RC,etal.Mitochondrial associated ubiquitin fold modifier-1 mediated protein conjugation in leishmania donovani[J].PLoS One,2011,6(1):e16156.

[19] Tatsumi K,Yamamoto-Mukai H,Shimizu R,etal.The Ufm 1-activating enzyme U ba5 is indispensable for erythroid differentiation in mice[J].Nat Commun，2011，2:181.

[20] Lee YJ,Johnson KR,Hallenbeck JM.Global protein conjugation by ubiquitin-like-modifiers during ischemic stress is regulated by microRNAs and confers robust tolerance to ischemia[J].PLoS One,2012,7(10):e47787.

[21] Robertson G,Bilenky M,Lin K,etal.cisRED:a database system for genome-scale computational discovery of regulatory elements[J].Nucleic Acids Res,2006,34:d68-d73.

[22] Ron D,Walter P.Signal integration in the endoplasmic reticulum unfolded protein response[J].Nat Rev Mol Cell Biol,2007,8(7):519-529.