肺動脈高壓相關因子的研究進展

王 鵬(綜述)，趙延恕(審校)

(中南大學湘雅二醫院心內科，長沙 410011)

肺動脈高壓(pulmonary arterial hypertension，PAH)是一類復雜的累及肺血管系統的病理生理綜合征。目前PAH定義為：海平面、靜息狀態下，右心導管檢查測定平均肺動脈壓>25 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)，或運動狀態下時平均肺動脈壓>30 mm Hg，且肺毛細血管契壓或左心室舒張末壓<15 mm Hg，肺血管阻力>3Wood單位。組織病理學定義：PAH是指血管收縮、細胞增殖、體內血栓形成，以及血管壁重構[1]。PAH診斷相對困難，處理極為棘手，致死率和致殘率高，嚴重影響著患者的生活質量，但其發病機制至今尚未完全闡明。近年來研究認為，PAH的主要病理變化是肺血管內皮細胞損傷、增生和功能障礙致使肺血管的結構重建，其中許多因子參與了此過程[2]。下面就近年來研究較多且熱門的因子予以概述。

1 調寧蛋白

調寧蛋白(calponin)為一種平滑肌所特有的調控蛋白，最初是從雞的胃中分離出來[3]，隨組織和種屬不同而有些變化。鈣調節蛋白按其等電點(isoelectric point，pI)的大小可分為三種異構體：堿性調寧蛋白(h1 calponin，h1 CaP，pI 8～10)大多表達于終末分化和非增殖性的平滑肌細胞；中性調寧蛋白(h2 calponin，h2 CaP，pI 7～8)主要分布于心肌組織和人的角化細胞；酸性調寧蛋白(h3 calponin，h3 CaP，pI 5～6)無組織表達特異性。其中h1 CaP在調節平滑肌收縮、抑制細胞增生、參與細胞信號轉導和維持細胞骨架等方面具有重要作用，因此一直是研究的重點。h1 CaP在內皮細胞內合成，相對分子質量為34×103，其染色體定位于19p13.2，為細肌絲結合蛋白，能夠抑制ATP酶的活性，在去磷酸化時此作用增強，磷酸化時此抑制作用被逆轉。它與肺血管重構的關系如下。

1.1抑制細胞增生 有研究發現，h1 CaP在增殖細胞中有明顯下調作用[4]。h1 CaP是一種抗細胞增殖基因，當生長停止的細胞重新進入細胞周期的G1期和增殖時h1 CaP的基因表達會下調。曹禹等[5]實驗證明與正常小鼠相比，PAH組小鼠平滑肌細胞中h1 CaP含量較對照組顯著降低。在骨折愈合中，h1 CaP基因剔除的小鼠依靠活化的骨膜成骨細胞的大量增生使得新骨形成增加[6]。在平滑肌肉瘤中(一種子宮平滑肌新生物)，h1 CaP表達減少，而將h1 CaP轉染人類平滑肌肉瘤細胞系，會發現它可以抑制腫瘤細胞增殖[7]。

1.2參與細胞骨架的維持 h1 CaP可通過與中間絲、微絲、微管蛋白及磷脂結合來穩定細胞骨架系統。h1 CaP不僅能與F-肌動蛋白結合，從而抑制肌動蛋白對ATP酶的活化，還能有規律地與原肌球蛋白結合，且與肌動蛋白的結合不受肌球蛋白影響。另外，h1 CaP還存在鈣調蛋白結構域，兩者的結合呈鈣依賴性，一旦兩者結合，h1 CaP對ATP酶的抑制作用可被逆轉[8]。在體外，h1 CaP結合磷脂，特別是帶負電荷的磷脂酰絲氨酸和磷脂酰肌醇[9]，連接不同類型細胞的質膜。當細胞受激動劑刺激時，h1 CaP從細胞骨架向質膜易位[10]。Takeoka等[3]研究發現，h1 CaP可以通過影響細胞骨架的活動抑制人纖維肉瘤HT 1080細胞的生長。

1.3參與細胞信號轉導 h1 CaP具有多個信號分子蛋白的結合域，除了結合肌動蛋白外，它可能還作為受體蛋白，與細胞外信號調節激酶、蛋白激酶C等很多蛋白配體結合，并且通過其磷酸化來調節激酶的活性，激活收縮誘導的信號轉導通路[10-11]。這些信號轉導通路與各種調節平滑肌收縮、胞質分裂、細胞分化和增殖的物質之間均存在著廣泛的聯系，h1 CaP可能就在其中發揮著重要的作用。

但h1 CaP在肺動脈平滑肌中的具體作用和作用機制尚需進一步探討及研究證明。利用h1 CaP進行早期干預，能否預防PAH和肺血管重構的發生，以及如何延緩其進展，也需進一步探討。

2 FHL-1

FHL(four and a half Lin-Isl-Mec domain)家族共有5個成員，即FHL-1、FHL-2、FHL-3、FHL-4、FHL-5/ACT(activator of CREM in testis)，該家族蛋白結構中含有四個半Lin-Isl-Mec(LIM)結構域，屬于LIM超家族。LIM結構域最早是在分離鑒定線蟲Lin-1基因、大鼠Isl-1基因和線蟲Mec-1基因編碼產物時發現的，LIM 是3種轉錄因子Lin-11、Isl-1和Mec-3的縮寫。FHL家族蛋白在胚胎發育、細胞分化、腫瘤發生發展及細胞骨架形成中起重要作用[12-14]。FHL家族在不同組織中表達具有特異性。FHL-1是FHL家族中表達最廣泛的成員，在骨骼肌中表達最豐富。FHL-1的LIM蛋白域是1個富含半胱氨酸的鋅指蛋白結構域[15]，可以介導蛋白質間的相互作用和轉錄因子、信號通路蛋白及細胞骨架蛋白間的相互作用。最近有研究表明，FHL-1高表達與肌細胞增生、肥大密切相關，推測其可能參與了肺血管重構[16-18]。Kwapiszewska等[19]用雙向聚丙烯酰胺凝膠電泳法檢測低氧誘導的PAH小鼠模型肺組織中各種蛋白質的表達情況，發現FHL-1隨肺動脈平滑肌細胞增生而表達不斷增加，進一步使用免疫印跡、免疫組織化學、RNA轉染等試驗也都證實肺動脈平滑肌細胞中的FHL-1表達上調；并且FHL-1的表達具有特異性，僅在肺循環系統可觀測到其表達上調，而在體循環系統未見上述變化，這正與低氧導致肺循環阻力增加而體循環阻力降低的效應相符。因此，FHL-1可能是PAH發生、發展及肺血管重構過程中一種發揮重要作用的蛋白，是一種調節各種PAH形成的新蛋白。

3 血管內皮生子因子

血管內皮生子因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，又稱血管通透因子，具有促進血管滲透及誘導血管生成的作用，是Leung等[20]于1989年在牛垂體濾泡星狀細胞體外培養液中首先純化出來的蛋白質。純化后的VEGF表現為一種具有肝素結合活性的同源二聚體多肽，每條單鏈含16個半胱氨酸，相對分子質量為(34～42)×103，根據VEGF mRNA的不同剪切方式，VEGF有五種分子變異，即VEGF-A，-B，-C，-D和血小板生長因子。VEGF存在兩類結合位點：受體結合位點與肝素結合位點。VEGF以旁分泌和自分泌方式，通過三種具有酪氨酸激酶活性的受體Flt-1、Flk-1/KDR(kinase insert domain receptor)和Flt-4，特異性地作用于靶細胞-血管內皮細胞而發揮生物學作用[21]。已有實驗證實，PAH的小鼠模型中，肺內VEGF表達增加。而VEGF的增加可能通過旁分泌方式作用于肺小動脈內膜，進而引起動脈壁平滑肌增生肥厚、內皮細胞增生或纖維化以及介導新生血管的形成，由此產生明顯的肺血管重建[22]。隨著病情的發展，血管中膜和內膜增厚、細胞外基質增多、血管彈性下降，血管狹窄或閉塞，肺細小動脈肌化，最終導致低氧性PAH的形成[23]。缺氧又可以誘導VEGF的轉錄，增強VEGF mRNA的穩定性，防止降解，從而間接提高VEGF的生理活性，由此形成惡性循環。還有研究表明，VEGF能通過促進內皮細胞合成和釋放內皮性舒張因子一氧化氮(nitric oxide，NO)來對抗內皮素的作用，增加妊娠期胎羊的肺血流量，降低肺血管阻力，促進NO釋放機制可能是通過激活磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-hydroxy kinase，PI3K)來實現的，因這一作用可被NO受體阻滯劑和選擇性PI3K阻滯劑所阻斷，所以NO可被視為發揮血管活性的下游因子[24]。VEGF是目前知道的最強的血管生長因子，它是內皮細胞的特異性有絲分裂原，也是一種有效的血管形成和血管通透性誘導因子，它通過與血管內皮細胞表面的特異性受體結合，使受體自身磷酸化，激發細胞內信號轉導，促進內皮細胞進行有絲分裂，提高血管通透性，致使基膜溶解，成纖維細胞、內皮細胞、平滑肌細胞遷移，從而促進新血管形成。因而，VEGF在肺血管重構過程中具有重要作用。

4 骨形成蛋白Ⅱ型受體

人骨形成蛋白Ⅱ型受體(bone morphogenetic protein receptor type Ⅱ，BMPR2)基因全長約190 kb，位于染色體2q33，由13個外顯子和12個內含子組成，其cDNA長約4 kb。BMPR2基因屬于轉化生長因子β(transforming growth factor-β，TGF-β)受體超家族成員，編碼一個跨膜絲氨酸/蘇氨酸激酶受體，其外顯子1～3編碼細胞膜外配體結合區，外顯子4編碼跨膜結構區，外顯子5～11編碼細胞內絲氨酸/蘇氨酸激酶結構區，外顯子12、13編碼細胞質尾部區[25]，其配體為骨形成蛋白(bone morphogenetic protein，BMP)。TGF-β信號轉導途徑包括BMPR2、BMPR1、BMP和受體底物Smads等。研究表明，BMPR2信號轉導通路抑制平滑肌細胞及內皮細胞的增殖與遷移,并促進平滑肌細胞表型的分化[26]。目前認為，BMPR2基因突變引起其功能缺陷是家族性PAH的重要發病機制。在歐美國家，50%的家族性PAH患者和26%的特發性PAH患者都存在BMPR2基因的突變[27-28]。另外發現在先天性心臟病合并PAH和服用減肥藥所致的PAH患者中，有一部分存在BMPR2基因的異常[29]。研究表明約1/3的家族性PAH和特發性PAH患者存在TGF-β/BMPR/Smads信號轉導通路缺陷，導致肺血管內皮細胞及平滑肌細胞增生異常及肺血管重構，是PAH發病的重要原因[30]。此外，由于BMPR2基因突變表達出不成熟或無功能的BMPR2蛋白，使BMPR2激酶活性喪失而阻斷下游的信號通路，導致肺血管內皮細胞微循環障礙和反應性動脈重構[31]。肺動脈平滑肌細胞BMPR2基因剔除的小鼠可出現BMPR2/BMP/Smads信號轉導異常，失去抑制平滑肌細胞生長的功能，從而導致肺血管平滑肌細胞增生肥厚及肺血管異常重構[32]。人類BMPR2主要表達于肺血管內皮細胞，而較少表達于平滑肌細胞，因此肺血管內皮細胞可能成為PAH治療的重要靶點。

5 Notch3

Notch家族是由一組高度保守的蛋白質組成，它們具有受體和調節基因轉錄的功能，可通過細胞內蛋白質之間的相互作用或細胞間信息傳遞而實現信號的調控。Notch信號途徑包括Notch受體、配體及其相應的細胞內信號分子。在脊椎動物中共發現了4種Notch蛋白的同源體：Notch1(Tan-1)、Notch2、Notch3和Notch4(Int-3)。Notch受體蛋白是一個約3×105的單鏈跨膜蛋白，包括胞外區、跨膜區和胞內區三部分，其中胞外區和胞內區均為高度保守區域。Notch信號途徑通過局部細胞間相互作用，實現細胞間通訊、胞質內的信號轉導以及核內轉錄，從而控制細胞的增殖、分化、凋亡、遷移及黏附等，在機體的整個生長發育過程的調控中發揮著重要的作用。喬莉娜等[33]實驗發現，肺切除聯合野百合堿誘導的PAH大鼠的肺動脈平滑肌細胞內Notch3 mRNA的表達明顯升高。隨后Li等[34]的進一步研究表明，低氧誘導的小鼠及野百合堿誘導的大鼠PAH模型中肺動脈平滑肌細胞內Notch3基因及蛋白表達增加；在人類非家族性PAH患者中Notch3基因及蛋白表達也明顯增加，且病情的嚴重程度與肺內Notch3表達量具有正相關性；通過對基因剔除Notch3的小鼠模型研究后發現，缺失Notch3的小鼠在低氧條件下不會產生PAH；使用分泌素抑制劑阻斷Notch3信號，可逆轉小鼠PAH。這些研究都說明Notch3信號與PAH的發生關系密切，Notch3信號途徑極有可能成為PAH治療的新靶點。

6 結 語

PAH是各種心肺疾病最常見且嚴重的合并癥之一，發病機制極為復雜，許多環節仍然不明確，且其臨床治療效果欠佳，探討其發病機制，控制和延緩PAH的發生、發展對治療疾病非常必要。目前，無論從細胞、分子水平還是從遺傳學角度，PAH發病機制的研究都取得了很大進步，近年來，對PAH形成機制以及各種因子的認識已經積極應用于臨床中，并取得了切實的療效。但仍需要繼續大量的研究，為臨床治療提供更有價值的信息，相信在不遠的將來，新的手段不斷被發現，PAH的治療將步入一個嶄新的時代。

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