牙髓干細胞治療脊髓損傷的研究進展

陳海聰(綜述)，曾 榮，胡資兵(審校)

(廣東醫學院附屬醫院骨科，廣東 湛江 524000)

脊髓損傷后可導致嚴重的機體功能紊亂甚至癱瘓或死亡，由于中樞神經不可再生，該病治療結果不太理想。隨著干細胞理論的發展，研究者發現干細胞移植療法在脊髓損傷修復中具有重大潛能，不僅能減少脊髓細胞的凋亡，還可促進患者損傷后功能的恢復[1-3]。目前胚胎干細胞[4]、臍帶血干細胞[5]、神經干細胞[6]及間充質干細胞[7]等被應用于脊髓損傷的細胞治療，并且取得了一定療效。自2000年以來，牙髓干細胞逐漸被人們所認識。牙髓干細胞同擁有間充質干細胞及神經嵴干細胞的特性，能分化為神經細胞以及其他類型的細胞，可作為一種新的種子干細胞用于脊髓損傷的治療。

1 牙髓干細胞

1.1牙髓干細胞的定義 干細胞是一類能自我復制，并且能夠分化成特定細胞類型的細胞[8]。根據干細胞的發育潛能分為三類：全能干細胞、多能干細胞和單能干細胞[9]。2000年Gronthos等[10]利用酶消化法培養人第三磨牙牙髓組織，得到了有細胞克隆能力及高度增殖能力的細胞，通過和骨髓間充質干細胞的對比研究，發現牙髓細胞具有與骨髓間充質干細胞極其相似的免疫表型及形成礦化結節的能力，同時還具有分化形成牙本質及髓樣復合物的能力，從而提出了牙髓干細胞的概念。目前為止，有5種干細胞被證明存在于牙齒中，分別為牙髓干細胞[10]、脫落乳牙干細胞[11]、端突干細胞[12]、韌帶周圍干細胞[13]和牙囊祖細胞[14]。以上5種干細胞均具有自我更新和多向分化能力，并有較強的克隆能力。

1.2牙髓干細胞的表面標記 明確干細胞表面分子標記是分離鑒定干細胞的重要手段。對于牙髓干細胞，目前仍缺乏特異性標記。來自中胚層細胞的標志物基質細胞抗原(STRO-1)及CD146在牙髓干細胞中均有表達，它們可用于牙髓干細胞未分化狀態的鑒定。多個實驗發現牙髓干細胞與骨髓間充質干細胞有極其相似的細胞表型[10,15-16]。免疫組織化學及流式細胞儀技術分析表明，牙髓干細胞可表達一系列間充質干細胞標志物(如CD29、CD90、CD73、CD105)及表達部分神經標志物(如巢蛋白、β微管蛋白Ⅲ、神經元核抗原、膠質纖維酸性蛋白、S100)，但不表達內皮及造血標志物(如CD14、CD34、CD45、CD11b、人白細胞DR抗原)[11,15]。

1.3牙髓干細胞的生物學特性

1.3.1自我更新能力 干細胞的自我更新及增殖能力的重要標準是單一細胞的克隆形成率[17]。Gronthos等[10]對牙髓干細胞及骨髓間充質干細胞的比較發現，牙髓干細胞在培養14 d后較骨髓間充質干細胞具有更強的克隆形成率。此外，有學者發現獼猴牙髓干細胞培養14 d后克隆形成率達到90%，證明牙髓干細胞在體外有明顯的更新及增殖能力[18]。

1.3.2多重分化能力 牙髓干細胞具有多重分化能力，不僅能夠分化成牙質細胞，還能向脂肪細胞、神經細胞、成骨細胞及軟骨細胞分化。還有學者發現大鼠牙髓干細胞在一定條件下能夠分化成軟骨細胞，并且他們通過形態學、分子學及生物化學也證明了這一點[19]。

1.3.3免疫調節能力 如骨髓間充質干細胞一樣，牙髓干細胞擁有強大的免疫調節能力。Yamaza等[20]通過動物實驗證明，牙髓干細胞具有免疫調節作用，移植牙髓干細胞能夠逆轉系統性紅斑狼瘡相關性紊亂，它們主要通過抑制輔助性T細胞17起作用。

2 牙髓干細胞治療脊髓損傷

2.1牙髓干細胞治療脊髓損傷的特點 作為臨床應用的理想干細胞來源，應當滿足一定的標準，如容易獲取、倫理上容易接受、安全的生物學性能、費用合適及具有近期、遠期治療效果。牙髓干細胞具有的特點[21]：來源廣泛、容易取得、無創；相對于其他成體干細胞，分離提取安全、容易；擁有間充質細胞特性同時也具有神經細胞特性，可以分化成為功能神經元；具有神經保護作用；能夠長期低溫儲存；倫理上無爭議。

2.2牙髓干細胞治療脊髓損傷的理論基礎——體外神經分化 作為來源于神經嵴細胞的牙髓干細胞，已被證明能表達多種神經細胞標志物，說明其具有向神經細胞分化的潛能，相對于其他類型的干細胞，其具有更加明顯的神經分化能力[11,15]。2004年，美國及瑞典學者發現牙髓干細胞能夠產生多種神經營養因子(如神經生長因子、腦源性神經營養因子、膠質細胞源性神經營養因子)，能夠促進多巴胺神經的存活，同時發現牙髓干細胞能分化成神經細胞，可應用于中樞神經系統疾病的治療[22]。2008年，有學者發現在一定的神經誘導條件下，牙髓干細胞能夠形成神經元的形態，并在基因及蛋白水平下表達神經元標志物，展現出能夠產生與功能性神經細胞相符合的鈉電流能力，甚至把牙髓干細胞移植至中腦后也發現其具有神經元的形態及表達神經標志物，這些證據說明牙髓干細胞具有治療神經系統疾病的潛能[23]。2011年，有學者發現在一定的生長因子作用下，免疫熒光及流式細胞儀檢測發現牙髓干細胞很快就表達神經細胞早期標志物(巢蛋白及β微管蛋白Ⅲ)，隨后表達中期及成熟神經細胞標志物，同時實時聚合酶鏈反應及蛋白質印跡檢測也發現各種神經標志物明顯上調[24]。干細胞修復脊髓損傷主要通過以下途徑：替代受損神經細胞；通過釋放生長因子促進神經再生。以上實驗表明，牙髓干細胞在一定的作用條件下，能夠分化為功能神經細胞，起到神經替代作用，同時也能分泌神經營養因子，激活體內處于休眠及受損的神經細胞，實現神經保護功能。牙髓干細胞誘導分化為神經細胞的分子機制與信號調控通路尚不清楚。

2.3牙髓干細胞治療脊髓損傷的應用——動物實驗 目前，脊髓損傷修復的研究主要圍繞以下幾個方面進行[25]：誘導受損的神經纖維再生，如直接給予多種神經生長因子促進其表達，為再生軸突提供橋梁；填充空洞和消除瘢痕組織；去除軸突生長抑制因子、髓磷脂相關糖蛋白與少突膠質細胞-髓磷脂糖蛋白等抑制軸突生長的因素。上述方法的臨床療效尚不理想，近年來隨著干細胞研究的發展及進步，干細胞開始應用于神經再生醫學領域，并取得了一定效果。牙髓干細胞作為新的種子干細胞也開始被應用于脊髓損傷的修復。

最初，研究者發現給脊髓半切模型的大鼠移植大鼠牙髓組織，然后通過熒光金標記法檢測運動神經元的變化，發現移植牙髓組織的大鼠運動神經元存活量顯著高于對照組，約增高115%倍，他們還發現移植的牙髓組織表達的膠質細胞源性神經營養因子顯著增高，表明移植的牙髓細胞主要通過分泌神經營養因子促進運動神經元細胞的存活[26]。從Gronthos發現牙髓干細胞的存在以來，經過10余年的發展，牙髓干細胞的研究愈加深入，已經被科學家應用于組織工程研究，如骨缺損修復、牙齒的修復，當然也包括中樞神經系統疾病[27-28]。2011年有科學家稱，通過移植未分化人脫落乳牙干細胞能夠促進急性脊髓損傷大鼠功能恢復，發現移植牙髓干細胞向神經元細胞及膠質細胞分化及增殖[29]。研究人員發現移植牙髓干細胞能夠通過多重神經再生機制，促進脊髓橫斷大鼠后肢功能的恢復，作用機制包括抑制脊髓損傷導致的神經細胞凋亡；通過抑制多重軸突生長抑制因子的作用促進軸突的再生；牙髓干細胞能夠分化成成熟少突膠質細胞，起到神經替代作用[15]。從牙髓組織移植治療脊髓損傷到牙髓干細胞治療脊髓損傷，在動物實驗中均取得了顯著效果，能夠改善動物的運動能力，表明牙髓干細胞可作為治療脊髓損傷不可或缺的干細胞來源。在進入人體應用之前，還需要更多的實驗明確牙髓干細胞在脊髓修復中的作用機制。

3 牙髓干細胞庫

牙髓干細胞庫的構建包括三個步驟：牙齒的收集、牙髓干細胞的分離及牙髓干細胞的貯藏。這些步驟簡單而相對無創，在低溫貯藏后牙髓干細胞仍然具有明顯的自我增殖及多向分化能力[30]。乳恒牙替換是一個正常的生理現象，相對其他干細胞的來源，從牙髓中獲取干細胞能避免倫理學爭議。從脫落的乳牙牙髓中分離培養干細胞用于貯藏，構建“牙髓干細胞庫”是可行的。牙髓干細胞能分化成多種細胞，可應用于多種疾病的治療，包括神經退行性病變、脊髓損傷、糖尿病、心血管疾病、免疫性疾病及骨骼肌肉疾病等。在患者年輕及健康時，貯藏他們的牙髓干細胞是必要的。牙髓干細胞庫在發達國家應運而生。

世界上第一家牙髓干細胞庫首先出現于美國，總部設在奧斯汀的美國BioEden公司，同時在英國及泰國建立了他們的國際實驗室，并且向澳大利亞、俄羅斯、印度及中東地區進行推廣。目前，牙髓干細胞庫在發達國家開始流行。日本廣島大學成立了日本首家牙髓干細胞庫，緊接著名古屋大學也成立了他們的牙髓干細胞庫。2008年，臺北醫科大學與日本廣島大學合作成立了臺灣地區首家牙髓干細胞庫，同年挪威也成立了他們的牙髓干細胞庫[31]。目前我國的牙髓干細胞庫正處于開始時期，有待進一步發展。

4 牙髓干細胞研究前景

2004年的調查顯示，全球范圍內接近有600萬脊髓損傷患者，每年每100萬人就有15～40新增病例[32]。2009年時，美國大概有100萬脊髓損傷患者，每年新增1.2萬病例[33]。2010年加拿大的調查顯示，整個國家約有85萬脊髓損傷患者，每年新增約3700病例[34]。牙髓干細胞是存在于牙髓組織中的成體干細胞，可分化形成多種細胞類型，牙髓干細胞具有重要的治療潛力。牙髓干細胞已應用于牙齒及顱面細胞的重建。目前研究認為，牙髓干細胞將有望應用到更加廣泛的醫學再生領域，尤其是治療中樞神經系統相關疾病，包括脊髓損傷。牙髓干細胞分離、提取方便，保存容易，價格便宜，許多發達國家已經建立了“牙髓干細胞庫”[31]。牙髓干細胞是臍帶血干細胞的補充，能夠修復結締組織、牙質組織、神經組織及骨組織。作為一種成體干細胞，牙髓干細胞避免了像胚胎干細胞方面的倫理學爭論[31]。我國應當嘗試建立自己的“牙髓干細胞庫”。

相對于其他干細胞，目前對牙髓干細胞的研究較少，起步較晚，還有許多問題需要解決。首先，目前牙髓干細胞缺乏明確的標志物，其分離鑒定難度大；其次，牙髓干細胞向神經細胞的分化機制尚未明確，還待進一步闡明；最后，牙髓干細胞治療脊髓損傷的時機選擇、用量選擇及使用部位選擇等需要進一步明確。這些問題還需要深入的探討及解決，只有牙髓干細胞的研究日趨完善，其應用于臨床才能逐漸實現。

5 小 結

脊髓損傷治療仍然是世界性難題，干細胞移植治療帶來了新的希望。作為來源于神經嵴細胞的牙髓干細胞，更容易分化為神經細胞。多個動物實驗證明，牙髓干細胞能夠在脊髓中遷移并且分化為神經細胞，改善動物的運動功能[15,29]。然而，牙髓干細胞治療脊髓損傷仍然面臨著巨大挑戰：如何獲取大量性質穩定的牙髓干細胞；牙髓干細胞治療脊髓損傷的機制；充分的臨床試驗。脊髓損傷發生后其病理生理過程會出現缺血壞死、細胞凋亡、炎性反應，最后導致脊髓空洞或者囊腫形成，因此針對其病理生理特點，牙髓干細胞聯合神經生長因子或者相關的細胞因子治療脊髓損傷可能會取得更加明顯的效果。

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