基于NMR代謝組學技術對山藥化學成分的研究

張敏 焦宏 郭捷

（山西省分析科學研究院，山西太原030006）

·基礎研究·

基于NMR代謝組學技術對山藥化學成分的研究

張敏*焦宏 郭捷

（山西省分析科學研究院，山西太原030006）

試驗采用基于NMR代謝組學的技術，分別對生山藥飲片、麩炒山藥及食用山藥的化學成分進行了研究，檢測出30多種化合物，包括腺苷、膽堿、多種氨基酸、有機酸及糖類等物質，其中有14種是3種山藥的共有成分。另外，對引起生山藥與麩炒山藥、食用山藥與藥用山藥差異的化學成分進行了指認，初步了解了炮制對山藥化學成分的影響及山藥藥材與食材的差異。

山藥；炮制品；代謝指紋；NMR；化學成分

山藥（Dioscorea batatas Decne）又名大薯、薯蕷、山芋等，是薯蕷科（Dioscoreaceae）薯蕷屬（Dioscorea L）多年生纏繞草質藤本植物，藥用其塊莖，始載于《神農本草經》，被列為上品。山藥根莖肉質潔白，營養豐富，是一種國際性藥食兼用作物，也是我國重要的出口特產蔬菜之一。山藥及其制劑廣泛、有效地應用于臨床，其炮制方面的研究也經歷了不斷發展深入的過程，其歷代炮制方法有清炒、麩炒、土炒、米炒等。麥麩味甘性平，具有中和的作用，山藥經麥麩炒制后可增強其補脾作用。生山藥與麩炒山藥為中醫臨床常用品種，生品以補腎生精，補脾肺之陰為主，用于脾虛久瀉，或大便泄瀉；麩炒品健脾和胃作用增強，用于脾虛泄瀉、久痢不止、尿頻、遺尿等癥狀。山藥廣泛分布于我國東北、華北、華中、東南、西南等丘陵和淺山地區，并形成許多地方品種，如太谷山藥，懷慶山藥，白玉山藥，花籽山藥和鐵棍山藥等。

近年來，許多研究者致力于山藥的研究分析，發現其具有許多活性成分，如糖類、蛋白質、氨基酸、微量元素等。現階段主要是應用GC-MS、HPLC等方法對山藥進行研究。白冰等人采用硅膠柱色譜分離純化，薄層色譜及波譜對山藥的化學成分進行分析，分離并鑒定了棕櫚酸、油酸、β-谷甾醇醋酸酯等12個化合物；王勇等人還利用GC-MS等技術，研究了懷山藥的脂肪酸成分，共檢測出27種脂肪酸，其中含有8種對人體有益的不飽和脂肪酸；張芳芳等人用HPLC法測定了麩炒山藥飲片中尿囊素的含量，發現不同產地麩炒山藥中尿囊素的含量差異較大。氣相色譜用于測定有揮發性的物質或者是能夠用衍生等方法使之揮發的物質，而液相色譜則更適用于測定那些具有生色團或官能團的物質。同時在測定過程中，二者均需要一個分離過程，一些微量成分可能會損失。

植物代謝組學（Metabolomics）是繼基因組學、轉錄組學和蛋白質組學之后興起的一門新學科，是系統生物學的重要組成部分。它是對生物體內所有代謝物進行分析，并尋找代謝物與生理病理變化的相對關系的研究方法。核磁共振（NMR）由于其靈敏性、無損性以及能夠根據特征峰定性的探測代謝物成分等優點，已發展為代謝組學中最常用的化學分析檢測技術。核磁測定樣品是非破壞性的，且只要很少的樣品預處理，就可以獲得提取物的結構信息，具有較好的重現性。用規范的提取分離程序獲得的特征提取物的核磁共振指紋圖譜，基本代表了植物中藥的整體化學組成，可以客觀、全面地反映植物中藥的特征。中藥的物質基礎是化學成分，化學成分通過試驗方法可以表征為指紋圖譜。根據文獻調研，秦海林等人對人參、天麻、黃連、虎杖、何首烏和掌葉大黃等天然藥物分別選擇適當的提取分離工藝，制備其特征總提物，測定了其1HNMR指紋圖譜。結果表明，所研究各種植物中藥的1HNMR指紋圖譜均有高度特征性和重現性，同一品種不同產地的樣品的1HNMR指紋圖譜有很好的一致性，人參、天麻等多種植物中藥特征總提取物的1HNMR指紋圖譜主要顯示了其活性成分的特征共振峰。本試驗在前人研究的基礎上建立了山藥的1HNMR指紋圖譜，測定并解析了山藥生品、炮制品及食用山藥化學成分的1HNMR圖譜，從而了解了3種山藥化學成分的差別。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

山藥飲片，購于黃河大藥房；麩炒山藥，購于榮華大藥房；食用山藥，購于美特好超市。

甲醇，分析純，北京化工廠；氘代甲醇，德國默克公司；Buffer緩沖液，pH值為6.0；蒸餾水。

Bruker 600-MHz AVANCEⅢ核磁共振波譜儀，布魯克公司；KQ5200E型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器有限公司；RE-52A旋轉蒸發器，上海亞榮生化儀器廠；TGL-16高速臺式冷凍離心機，長沙湘儀離心機有限公司；ESJ120-4電子天平，沈陽龍騰電子稱量儀器有限公司；XW-80A渦旋混合器，上海精科實業有限公司。

1.2 試驗方法

分別將干山藥藥材、麩炒山藥藥材、新鮮的長山藥稱取400 mg進行液氮研磨，加入體積濃度50%的甲醇溶液6 mL，渦旋1 min，超聲提取30 min，3 000 r/min離心30 min，移取上清液至25 mL的圓底燒瓶，揮干試劑，殘渣加入400 μL的緩沖液和400 μL的CD3OH溶解，13 000 r/min離心15 min，轉移600 μL溶液至核磁管中，分別進行核磁共振分析。

2 結果與討論

3種山藥氫核磁總圖譜如圖1所示。在氫核磁圖譜上，山藥的信號分布在δ9.20～δ0.92之間。根據核磁共振譜線所對應的化合物特征，可將譜圖分為“氨基酸區”“碳水化合物區”“芳香區”3個區域。

圖1 3種山藥的1HNMR總圖譜

為了更直觀清晰地對3種山藥的成分進行對比分析，下頁圖2為3種山藥的1HNMR圖譜局部放大圖。

氨基酸區處于譜圖的高場端（δ3.0～δ0.0），這部分的信號比較清晰，容易識別。特征吸收峰從高場到低場依次為亮氨酸δ0.98（d，6.0 Hz），δ0.96（d，6.0 Hz），異亮氨酸δ0.96（t，7.0 Hz），δ1.02（d，7.2 Hz），纈氨酸δ1.00（d，7.2 Hz），δ1.05（d，7.2 Hz），蘇氨酸δ1.33（d，6.6 Hz），乳酸δ1.35（d，6.6Hz），丙氨酸δ1.48（d，7.2Hz），精氨酸δ1.67（m），δ1.73（m），δ1.91（m），丙酮酸δ2.21（s），r-氨基丁酸δ2.31（t，7.2 Hz），δ3.01（t，7.2 Hz），谷氨酰胺δ2.41（m），蘋果酸δ2.47（dd，15.3，9.4 Hz），檸檬酸δ2.72（d， 16.2 Hz），δ2.55（d，16.2 Hz），天冬氨酸δ2.64（d，9 Hz），δ2.81（dd，17.4，3.6 Hz），天冬酰胺δ2.96(dd，16.8，9.0 Hz），δ2.85（dd，7.8，3.6 Hz）。與麩炒山藥、干山藥飲片相比，食用山藥各成分含量較高。與食用山藥相比，麩炒山藥和和山藥飲片δ1.18（t，7.2Hz）附近新增葡萄糖苷特征吸收峰，δ2.21（s）附近新增丙酮酸特征吸收峰，推斷為炮制后的產物。

碳水化合物區處于譜圖的中段（δ5.5～δ3.0），主要包含了糖類和氨基酸的α-H的信號。這一區域的信號相對較強，具有明顯的糖類化合物的信號特征，如葡萄糖的α、β端基差向異構體能夠很清晰的鑒別出來，它們各自的雙重特征峰極為明顯，α：δ5.18（d，3.6 Hz），β:δ4.57（d，7.8 Hz）；5.40（d，3.6 Hz）被歸屬于蔗糖的特征信號峰。與麩炒山藥、干山藥飲片相比，食用山藥δ4.28（dd，9.4，3.3 Hz），蘋果酸含量較高，δ5.37（s）獨有尿囊素特征吸收峰。與食用山藥相比，炮制后的山藥蔗糖含量降低，β-葡萄糖、α-葡萄糖含量增加，麩炒山藥比山藥飲片增加更明顯。

芳香區處于譜圖的低場端（δ9.2～δ5.5），信號與其他2個區域的信號相比相對較弱，特征吸收峰從高場到低場依次為尿苷δ5.87（dd，24.6 Hz，6.6 Hz），δ7.93（d，8.4 Hz），腺苷δ6.02（d，6.6 Hz），δ8.35（s），δ8.23（s），鳥苷δ5.93（d，7.8 Hz），馬來酸δ 6.30（s），富馬酸δ6.54（s），色氨酸δ7.14（d），δ7.21（t），δ 7.29（s），δ7.47（d，8.4Hz），甲酸δ8.47（s），葫蘆巴堿δ9.15（s），δ8.86（dd，12，7.2 Hz），δ8.09（t，6.6 Hz）。炮制后麩炒山藥新增加5-羥甲基糠醛特征吸收峰δ6.66（d，3.6 Hz），δ7.52（3.6），δ9.47（s）。δ6.52（d，3.6 Hz）、δ7.25（d，3.6 Hz）為其他5-羥甲基糠醛類似物特征吸收峰。

3種山藥化學成分及其氫核磁共振數據見下頁表1。

圖2 3種山藥的1HNMR圖譜局部放大圖

3 結論

作為一種新型科學技術，核磁代謝組學技術被應用于植物化學成分的鑒定與分析，具有簡單、快速、高效的等特點。本試驗將核磁共振技術應用于山藥的化學成分的分析，利用了核磁共振自身多手段的技術優勢，并結合代謝組學技術的整體評價性，對3種山藥樣品進行了1HNMR分析，進而掌握了3種山藥的化學成分以及它們之間的差異，為更好的開發利用山藥的營養價值提供參考依據，對于我國藥用資源的開發有著積極的意義。該方法在1HNMR測量中有效的消除了樣品中水分對測量的干擾，而且簡化了樣品的預處理環節，所獲取的1HNMR清晰，信息完整，達到了指紋譜的基本要求，故可以應用于更為廣泛的領域。

表1 3種山藥化學成分及其氫核磁共振數據

［1］龔千峰.中藥炮制學［M］.北京：中國中醫藥出版社，2003：132.

［2］原思通.醫用中藥飲片學［M］.北京：人民衛生出版社，2001：408.

［3］陳艷，姚成.淮山藥中氨基酸含量的測定［J］.氨基酸和生物資源，2004，26（2）：47-48.

［4］張兵，謝九皋.山藥營養成分的研究［J］.湖北農業科學，1996（6）：56-58.

［5］廖朝暉，朱必鳳，劉安玲，等.山藥主要生化成分含量的測定［J］.韶關學院學報，2003，24（6）：67-69.

［6］徐琴，徐增萊，沈振國，等.淮山藥多糖的研究［J］.中藥材，2006，29（9）：909-912.

［7］顧林，姜軍，孫婧.山藥多糖的分離純化及其結構鑒定［J］.食品科技，2007（5）：109-112.

［8］顧林，姜軍.山藥多糖的分離純化及組成研究［J］.食品科學，2007，28（9）：158-161.

［9］王剛，杜士明，肖淼生，等.山藥多糖的提取分離及山藥總多糖的含量測定［J］.中國醫院藥學雜志，2007，27（10）：1 414-1 416.

［10］白冰，王勇，李明靜，等.懷山藥化學成分研究［J］.中國中藥雜志，2008，33（11）：1 272-1 274.

［11］白冰，劉繡華，王勇，等.懷山藥化學成分研究［J］.化學研究，2008，19（3）：67-69.

［12］王勇，趙若夏，白冰，等.懷山藥脂肪酸成分分析［J］.新鄉醫學院學報，2008，25（2）：112-113.

［13］張芳芳，李偉東，楊光明，等.HPLC法測定麩炒山藥飲片中尿囊素的含量［J］.南京中醫藥大學報，2010，26（2）：146-148.

［14］QIN HAI LIN，SHANG YU JUN，ZHAO WEI，et al.Identification of Chinese Goldthread（Coptis chinensis）by1HNMR［J］.Chinese Traditional and Herbal Drug，2000，31（1）：48-50.

［15］QIN HAI LIN，ZHAO TIAN ZENG，YUAN WEI MEI，etal. Assignments of The1HNMR Finger Prints of the Roots of Polygonumcuspidatum，Polygonum Multiflorum，Rheum Palmatum and Rheum Tanguticum Assignments［J］.Acta Pharmaceutica Sinic（藥學學報），1999，34（11）：828-834.

［17］QIN HAI lIN，WANG ZHENG TAO，XU LUO SHAN，et al. Authentication of Traditional Chinese Herbal Medicines（TCHM）by Fingerprints of Characteristic General Constituents［J］.China Journal of Chinese Materia Medica，2001，26（1）：4-9.

［18］WARD J L，HARRIS C，LWIS J，et al.Assessment of1H NMR Spectroscopy and multivariate analysis as a technique for metabolite fingerprinting of arabidopsis thaliana［J］. Phytochem，2003，62：949-957.

Studies on chemical constituents of the yam by1HNMR-based meta bolomics

ZHANGMin*JIAOhong GUOJie
（Analytical science research institute of Shanxi province，Shanxi taiyuan 030006，China）

The studies on chemical constituents of dried yam slices,bran fried yam and edible yam were carried out respectively by means of1HNMR-based metabolomics.Over thirty compounds including adenosine,choline,amino acids, organic acids,sugars and other substances were detected,of which fourteen were common components in three kinds of yams.Their respective characteristic chemical compositions were indicated.Effect of processing on the chemical components of yam and the differences between edible yam and dried yam slices,bran fried yam were reviewed.

yam；processed products；metabolic fingerprinting；NMR；chemical constituent

TS255.5

A

1673-6044（2014）04-0019-05

10.3969/j.issn.1673-6044.2014.04.007

*張敏，女，1982年出生，2009年畢業于山西大學無機化學專業，碩士，工程師。

2014-11-21