林蛙輸卵管總RNA提取方法的優化及RT－PCR驗證

李稼暉，劉回民，陳文超，劉景圣

（吉林農業大學 食品科學與工程學院，長春 130118）

總RNA提取是一個分離純化的過程，由于林蛙輸卵管組織包含大量分泌細胞，且細胞體積大，富含蛋白質和膠原物質，因此從林蛙輸卵管組織中提取高質量總RNA的難度較大.RT－PCR驗證是對總RNA質量高低的直接評價.甘油醛－3－磷酸脫氫酶（glyceraldehyde－3－phosphate dehydrogenase，GAPDH）基因作為管家基因，在所有組織中都高豐度表達，在同種細胞或組織中的蛋白表達量基本恒定，因此可作為RT－PCR的內參基因.延伸因子（elongation factors，EF）是在mRNA翻譯時促進多肽鏈延伸的蛋白質因子，延伸因子在各種組織中都較高水平地表達，并且相近物種間保守性較強，也適合作為RT－PCR的內參基因.

為提高總RNA得率和完整性，本文通過對已有方法的改良和優化獲得了高純度的RNA，并比較3種不同試劑對林蛙輸卵管組織總RNA的提取效果，確定RNAiso Plus為最佳裂解劑.先對其操作過程、用量和裂解時間等進行優化，進一步純化后，再對GAPDH及EF－1－α基因片段進行RT－PCR，并驗證該方法提取的總RNA質量.

1 材料與方法

1.1 林蛙輸卵管組織的獲取

將2013年3月初捕獲的長白山地區雌性林蛙（3～5年）解剖，取其輸卵管，剪成小段置于2.0mL離心管中，用液氮冷凍處理，－80℃冰箱中保存備用.

1.2 試劑與儀器

1.2.1 試 劑 TRIzol購自美國Invitrogen公司；RNAiso Plus，DNA Marker2000，PrimeScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit和Taq DNA Polymerase購自日本TaKaRa公司；焦炭酸二乙酶（DEPC）購自北京鼎國生物有限公司；無水乙醇、氯仿、異丙醇、檸檬酸鈉、氯化鈉、十六烷基三甲基溴化銨（CTAB）、酚、醋酸鈉和異戊醇均為國產分析純試劑.

1.2.2 儀 器 EPS 301型電泳儀（美國GE公司）；FRESCO17型高速低溫離心機（美國Therom Fisher Scientific公司）；NanoDrop 2000型微量紫外分光光度計（美國Therom Fisher Scientific公司）；AG 22331Hamburg型PCR儀（德國Eppendorf公司）；K20型金屬浴（杭州奧盛儀器公司）.

1.3 方 法

1.3.1 裂解劑的選擇 分別使用 TRIzol法［16］、RNAiso Plus法［17］和改良的CTAB［18］法進行總 RNA提取，比較提取效果，選擇最佳的提取方法并進一步改良.

1.3.2 改良RNAiso Plus法的建立及條件優化 以RNAiso Plus法為基礎，進行如下改良：1）液氮研磨過程中，在液氮未揮發完前進行粗粉碎，液氮揮發完后立刻細磨組織4～6s，迅速補充液氮，重復2～3s，至組織充分粉碎；2）加入RNAiso Plus完全覆蓋組織粉末，當凝固的RNAiso Plus試劑融化至研杵可輕輕碰碎的程度時，立即攪動，使底部組織與RNAiso Plus試劑充分混勻，完全融化后繼續研磨5min；3）將離心除去組織沉淀過程中處于中部黏稠的膠原層轉移至1.5mL EP管中；4）沉淀總RNA過程選擇V（異丙醇）∶V（鹽溶液）＝4∶3為沉淀劑（鹽溶液為0.8mol／L檸檬酸鈉和1.2mol／L NaCl混合液）.

在每0.1g組織中加入梯度增加的RNAiso Plus試劑，裂解時間20min；在每0.1g組織中加入2.2mL RNAiso Plus試劑，靜置裂解反應時間為梯度增加.以此確定RNAiso Plus最佳添加量和最佳裂解時間.

小說的要義不在于準確無誤地臨摹生活，卻可在一定程度上反映社會現實。 自道教的風水學說傳入朝鮮半島，與當地流傳的薩滿信仰結合后，形成了具有朝鮮民族特色的民俗文化。 這些民俗文化和人文觀念在以堪輿為主題的漢文小說中也可見一斑。 朝鮮半島的堪輿風俗和社會觀念影響了其小說創作，致使大批以堪輿為主題的漢文小說應運而生，同時，這些堪輿主題的漢文小說也在一定程度上反映了朝鮮半島的喪葬民俗和人文觀念。

1.3.3 總RNA的純化 將總RNA 52.0μL，質量分數為1‰的DEPC水10.0μL，10×PCR緩沖溶液8.0μL，DNase 10.0μL置于0.5mL離心管中，輕輕混勻后置于37℃金屬浴中，反應20min；加入100μL體積分數為1‰的DEPC水，90μL酚和90μL氯仿，充分混勻置于4℃離心機中，靜置10min，13 500r／min離心10min；將上清液置于1.5mL EP管中，加入無水乙醇使其體積分數為25%，靜置5min，于4℃，13 500r／min離心5min，再將上清液置于新EP管中；加入等體積異丙醇沉淀，混勻后靜置5min，于4℃，13 500r／min離心10min；用體積分數為75%的乙醇洗滌沉淀1～2次；除去乙醇，用50μL DEPC水復溶，于－80℃保存.

1.3.4 總RNA的質量檢測 測定樣品A260和A280的吸光度值，計算A260／A280，將吸光度換算為質量濃度并計算得率.用質量分數為1%的瓊脂糖凝膠電泳鑒定總RNA的完整性.

1.3.5 總RNA穩定性驗證 將純化后的總RNA樣品分成兩組，一組于－80℃保存，另一組于密封的離心管中37℃放置2h，電泳鑒定其完整性.

1.3.6 RT－PCR檢測 根據蛙類的GAPDH基因（GenBank登錄號：NM＿001087098.1）和非洲爪蟾、日本雨蛙及中華大蟾蜍延伸因子基因（EF－1－α）中的高度保守序列（GenBank登錄號：BC041196，AB199910，AB066590）設計RT－PCR引物列于表1.按照Takara反轉錄試劑盒PrimeScriptⅡ1st Strand cDNA Synthesis Kit使用說明合成cDNA第一鏈.PCR反應體系為：RT反應液1μL，dNTP混合液2μL（2.5mmol／L），PCR緩沖液4μL，上下游引物各0.5μL（25μmol／L），Taq DNA聚合酶0.15μL，ddH2O 16.85μL.反應條件為：94 ℃預變性5min，94 ℃ 30s，50 ℃（GAPDH）／55℃（EF－1－α）30s，72℃1min，循環30次，72℃延伸10min.

表1 RT－PCR引物Table 1 RT－PCR primers

2 結果與分析

2.1 最佳方法的確定

將林蛙的輸卵管組織分別使用不同方法進行總RNA提取，每次做3個平行實驗，結果如圖1所示.由圖1（A）可見：改良的CTAB法提取RNA導致基因組DNA污染較大，并伴隨較大程度的降解；TRIzol法與RNAiso Plus法提取效果相近，由5S條帶相對亮度均過高可知存在一定程度的降解.由圖1（B）可見，5S條帶相對亮度顯著降低，28S相對18S條帶亮度升高，表明經改良的RNAiso Plus法相對其他方法在保持總RNA完整性方面效果最佳.

圖1 不同方法提取的總RNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.1 AGE of total RNA extraction with different methods

不同方法提取總RNA的A260／A280及得率如圖2所示.由圖2可見，改良后的RNAiso Plus法相對改良前提取的總RNA得率增大，純度變化較小.其中改良CTAB法的高得率和高A260／A280值為DNA殘留所致.

綜上可見，改良的RNAiso Plus法是林蛙輸卵管總RNA提取的最佳方法.原因如下：1）充分粉碎.先在液氮中對組織進行粗粉碎，待液氮揮發后，溫度上升使組織略膨脹，與研缽摩擦力增大，再繼續細磨使組織充分粉碎（該步驟易使RNA因溫度過高而被內源性RNA酶酶解，因此研磨后應立即補充液氮）.2）加入裂解劑后，縮短組織解凍時間.若待裂解劑完全融化再研磨，則底部的高膠原蛋白組織小碎片易重新黏連而無法研碎，使組織不能充分裂解，因而要提前研磨.3）回收利用膠原層.裂解后離心產生的膠原層是由于膠原蛋白大量吸水所致，因此形成的立體網狀結構中含有大量的RNA，應與上清液一同進行氯仿分相，加氯仿后會使膠原變性失水并釋放所包含的RNA.

圖2 不同提取方法對總RNA質量的影響Fig.2 Effects of different extracting agents on total RNA quality

2.2 裂解劑添加量對RNA提取的影響

圖3為不同RNAiso Plus添加量提取的總RNA瓊脂糖凝膠電泳.由圖3可見：當每0.1g組織中裂解劑添加量小于1.6mL時，有基因組DNA污染；當裂解劑添加量大于1.6mL時，基因組DNA被除去，且條帶亮度不斷提高.

圖4為不同RNAiso Plus添加量對總RNA質量的影響.由圖4可見，除去DNA污染的組，裂解劑添加量為2.2mL時得率最高，此后A260／A280的值提高較小且得率降低，這是由于溶液體系增加，在沉淀過程中損失率相對提高所致.為了獲得更高的得率，選擇2.2mL作為裂解劑的最佳添加量.

圖3 不同RNAiso Plus添加量提取的總RNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.3 AGE of total RNA extracted with different RNAiso Plus dosages

圖4 不同RNAiso Plus添加量對總RNA質量的影響Fig.4 Effects of different RNAiso Plus dosages on total RNA quality

2.3 裂解時間對RNA提取的影響

圖5 不同裂解時間對總RNA提取影響的電泳Fig.5 Effect of different extracting time on total RNA extracted

圖5為不同裂解時間對總RNA提取影響的電泳.由圖5可見，隨著裂解時間的增加，條帶亮度不斷提高，當裂解時間為30min時，RNA開始降解，這是因為裂解時間過長，RNA被內源RNA酶逐漸酶解所致.圖6為不同裂解時間對總RNA質量的影響.由圖6可見，增加裂解時間可提高總RNA的提取率，對A260／A280影響較小.為保證總RNA的完整性，選擇最佳裂解時間為25min.

2.4 總RNA純化

在每0.1g組織中添加2.2mL裂解劑，裂解時間為25min的條件下，提取的總RNA經純化后的效果如圖7所示.由圖7可見，純化后泳道更清晰，表明酚和糖蛋白等污染已得到較大控制.

圖6 不同裂解時間對總RNA質量的影響Fig.6 Effects of different extracting time on total RNA quality

圖7 純化前后的總RNA瓊脂糖凝膠電泳Fig.7 AGE of total RNA befor and after purified

圖8為總RNA的純化結果.由圖8可見，純化后總RNA的得率略下降，但A260／A280值提高較大，即純化效果較好.

圖8 總RNA的純化結果Fig.8 Purification of total RNA

2.5 RNA穩定性驗證

提取的總RNA在37℃放置2h后的電泳條帶清晰完整，與－80℃保存效果基本一致，表明提取的總RNA質量較高，未受RNase污染，利于保存及后續實驗.

圖9 林蛙GAPDH基因及EF－1－α基因片段的RT－PCRFig.9 RT－PCR of GAPDHand EF－1－α gene of R.chensinensis

2.6 RT－PCR驗證

圖9為林蛙GAPDH基因及EF－1－α基因片段的RT－PCR.由圖9可見，二者條帶清晰，無非特異性擴增，條帶的分子量與理論PCR產物大小相符，表明提取的總RNA滿足RT－PCR條件，可用于對林蛙輸卵管組織中mRNA的反轉錄并進行PCR擴增.

綜上所述，本文經改良提取方法、條件優化及進一步純化，提取林蛙輸卵管組織總RNA的A260／A280平均值為1.96，平均得率為56.1μg／g，與未優化相比，得率和質量均提高較大.穩定性實驗結果表明，RNA穩定性良好；經RT－PCR驗證，該方法提取的總RNA質量可滿足后續實驗要求.

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