津力達對高脂飲食誘導的胰島素抵抗大鼠血清瘦素、脂聯素的影響

段力園，趙 靜，劉頤軒，宋光耀

胰島素抵抗(IR)是2型糖尿病以及多種代謝性疾病如肥胖、代謝綜合征的共同病理生理基礎，脂肪源性細胞因子分泌的異常與IR的形成和發展密切相關［1-3］。研究顯示，多種單味中藥，如黃連、人參、黃芪等可以改善IR［4-8］。津力達是由17味中藥所組成的中藥復方制劑，臨床試驗證實其可有效降低血糖，改善2型糖尿病患者的癥狀。既往研究表明，津力達可保護胰島β細胞，增加胰島素分泌，改善IR［9-11］，但其作用機制尚不明確。我們擬通過本研究，觀察津力達對IR大鼠脂肪源性細胞因子分泌的影響，探討其改善IR的部分機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及模型制備 雄性SD大鼠36只，體重125～145 g，購于中國食品藥品檢定研究院實驗動物資源研究所［合格證號:slxk(京)7009-0017］。飼養條件為:每籠2只，適應性喂養1周后稱重，隨機分為正常對照組12只和高脂飲食組24只。正常對照組給予正?；A飼料(總熱量為348 kcal/100 g，碳水化合物占 65.5%、脂肪占10.3%、蛋白質占24.2%)，高脂飲食組給予高脂飼料(總熱量為501 kcal/100 g，碳水化合物占20.1%、脂肪占59.8%、蛋白質占20.1%)，所有飼料購于河北醫科大學實驗動物中心。兩組分別喂養6周后，每組隨機選取6只行高胰島素-正葡萄糖鉗夾試驗，判斷造模是否成功。

1.2 高胰島素－正葡萄糖鉗夾試驗 參考Kraegen等［12］于1983年建立的高胰島素-正葡萄糖鉗夾技術，具體操作步驟:隨機選取6只大鼠禁食12 h，過夜后于次晨稱重，空腹狀態下以3%戊巴比妥鈉(北京Solarbio公司)行腹腔注射麻醉，劑量為40 mg/kg。在麻醉狀態下，于大鼠頸前右側斜行剪開長1.5 cm切口，行右側頸動、靜脈插管，插入長度為2.0～2.5 cm，導管經皮下從頸后引出，用肝素(100 U/ml)抗凝封管，最后將導管結扎固定于頸后皮膚。大鼠清醒后單籠飼養，自由攝食、飲水，并注意保暖、抗感染。4～5 d后，大鼠應激狀態消失，表現為體重恢復至插管前水平，再次禁食12 h，過夜，第2天清晨在清醒狀態下行高胰島素-正葡萄糖鉗夾試驗。頸動脈導管連接裝有肝素生理鹽水的注射器，濃度為50 U/ml;頸靜脈導管通過三通管連接雙通道微量注射泵(浙江醫科大學，WZS-50F)，一端連接濃度為40 mU/ml胰島素注射液(江蘇萬邦公司)，另一端連接30%葡萄糖注射液。先用血糖儀(美國羅氏，Advantage)測定大鼠基礎血糖，然后以4 mU/(kg·min)的恒定速率輸注胰島素溶液，每間隔5 min測定1次血糖;當血糖降至低于基礎值時，開始以9～14 mg/(kg·min)的速度輸注30%的葡萄糖注射液，隨后每間隔10 min測定大鼠血糖1次，根據血糖水平調整葡萄糖注射液的輸注速率，使大鼠血糖穩定在(5.0±0.5)mmol/L。當血糖穩定后，每隔5 min測定1次血糖，記錄連續6次血糖的平均值，計算葡萄糖輸注率(GIR)。GIR=血糖穩定時葡萄糖輸注速率×葡萄糖濃度/體重(g)/60，此結果即為評價大鼠胰島素敏感性的指標。

1.3 藥物干預 高胰島素－正葡萄糖鉗夾試驗確定IR大鼠模型造模成功后，將高脂飲食組剩余18只大鼠隨機分為高脂飲食對照組、津力達組和二甲雙胍組，每組6只。津力達組給予津力達(石家莊以嶺藥業股份有限公司)超微粉末生理鹽水混懸液3.0 g/(kg·d)灌胃;二甲雙胍組給予二甲雙胍(中美上海施貴寶制藥有限公司，批號:1401080)粉末生理鹽水混懸液0.2 g/(kg·d)灌胃;正常對照組和高脂飲食組給予與二甲雙胍組等量生理鹽水灌胃，每天9:00灌胃1次，持續8周。正常對照組繼續給予基礎飼料喂養，其余各組繼續高脂飼料喂養，藥物干預期間飼養條件不變，根據體重調整給藥量。

1.4 大鼠血清指標的測定 藥物干預8周后，大鼠禁食12 h過夜，次晨稱重并用3%戊巴比妥鈉40 mg/kg腹腔注射麻醉，并在麻醉狀態下開腹，選取腹主動脈取血，所采血標本中加入總體積1%的肝素抗凝劑，收集后室溫(20～50℃)靜置30 min，低溫離心機(德國Hettich公司，EBA12R)3000 r/min離心15 min，取上清，-80℃低溫冰箱(青島海爾特種電器有限公司，DW86L486)分裝保存以備使用。酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(上海藍基生物科技有限公司)測定瘦素、胰島素、脂聯素、抵抗素、游離脂肪酸(FFA)，嚴格按照說明書進行操作。具體操作步驟:取出 ELISA試劑盒，于室溫(20～50℃)放置30 min;取出酶標板，按照標準品的次序分別加入50μl的標準品溶液于空白微孔中;空白孔中加入50μl樣品，空白對照孔加入50μl PBS(pH 7.0～7.2);在各孔中加入100μl的酶標記溶液(不含空白對照孔);將酶標板用封口膠密封后，37℃孵育箱(上海浦東躍欣科學儀器廠，101A-2)孵育反應1 h;用試劑盒中提供的清洗液(濃縮洗滌液以1∶100的比例與蒸餾水稀釋)充分清洗酶標板5次，保持各孔有充足的水壓;酶標板洗滌后用吸水紙徹底拍干;各孔加入顯色劑A和B各50μl;37℃下避光反應10～15 min;各孔加入50μl終止液，終止反應;用酶標儀(芬蘭，Multiskan Mk3)于560 nm處測定吸光率。

1.5 統計學方法 采用SPSS 13.0統計軟件進行分析，計量資料以均數±標準差(x±s)表示，兩樣本均數比較采用t檢驗，多樣本均數比較采用完全隨機設計單因素方差分析，α=0.05為檢驗水準。

2 結果

2.1 GIR 喂養6周后高脂飲食組GIR為(14.9±0.82)mg/(kg·min)明顯低于正常對照組(26.5±0.78)mg/(kg·min)(P＜0.05)。提示高脂飲食組大鼠出現明顯的IR［13］，高脂飼料喂養成功建立了IR大鼠模型。藥物干預8周后，GIR正常對照組為(27.1±0.89)mg/(kg·min)，高脂飲食對照組為(15.5±0.69)mg/(kg·min)，津力達組為(23.9 ±0.81)mg/(kg·min)，二甲雙胍組為(24.3±0.69)mg/(kg·min)。高脂飲食對照組GIR較正常對照組降低，津力達組及二甲雙胍組GIR較高脂飲食對照組升高(P＜0.05)，但兩組間比較差異無統計學意義(P＞0.05)。

2.2 血清指標 藥物干預8周后，高脂飲食對照組血清瘦素、胰島素、抵抗素、FFA較正常對照組升高，脂聯素水平下降，差異有統計學意義(P＜0.05)。與高脂飲食對照組比較，津力達組和二甲雙胍組血清瘦素、胰島素、抵抗素、FFA水平均降低，血清脂聯素水平升高，差異有統計學意義(P＜0.05)，但兩組間比較差異無統計學意義(P＞0.05)，見表1。

表1 藥物干預8周后4組大鼠血清瘦素、胰島素、脂聯素、抵抗素、游離脂肪酸的變化(x±s)

3 討論

近年來，由于人們生活水平的提高和不健康的飲食方式，高脂血癥的發病率逐年升高。高脂血癥是促使IR、動脈粥樣硬化、冠心病等疾病發生的重要危險因素［13］。這些疾病可以造成人體多種靶器官的損害，嚴重降低了患者生活質量，縮短了患者的預期壽命。據報道，我國≥18歲居民血脂異常率高達18.6%［14］。目前高脂血癥尚無統一的診斷標準。一般來講，血漿總膽固醇濃度＞5.72 mmol/L即可定為高膽固醇血癥，血漿甘油三酯濃度 ＞1.70 mmol/L為高甘油三酯血癥。臨床主要應用的降脂類藥物有他汀類、煙酸及其衍生物、貝特類等藥物，而調整飲食習慣及增加體育活動、控制體重等生活方式的改變是預防和治療血脂異常的關鍵。

研究表明，脂肪組織不僅是能量儲備器官，還是一個代謝活躍、功能復雜的內分泌器官［15］。脂肪組織可以分泌許多與糖和脂肪代謝相關的脂肪因子，通過這些因子廣泛地影響和調節機體的能量代謝及各種功能［16］，其中瘦素、胰島素、脂聯素、抵抗素和FFA在IR的形成和發展中起著重要作用。

瘦素主要由白色脂肪組織產生，可以引起食欲缺乏和機體能量消耗增加從而使體重減輕，有觀點認為，瘦素是IR發展的獨立危險因素［17］。在肥胖以及IR狀態下，往往表現為瘦素抵抗，即高瘦素血癥，但因其與受體結合障礙或者受體表達下調，血清瘦素不能發揮生理作用，從而產生瘦素抵抗［18］。本實驗中，高脂飲食對照組中血清瘦素、胰島素水平升高，表明高瘦素血癥使“脂肪-胰島素軸”反饋機制破壞，導致高胰島素血癥或IR，或將進一步導致肝內脂肪蓄積。津力達和二甲雙胍均能降低血清瘦素以及胰島素水平，減輕高瘦素血癥以及IR。

脂聯素是由脂肪組織分泌的唯一發揮保護作用的脂肪細胞因子，在體內的生理作用主要是增加胰島素敏感性，促進脂肪代謝，增加能量消耗，抑制內源性葡萄糖生成從而使IR減輕［19］。而在肥胖以及IR患者血中脂聯素濃度明顯下降，導致胰島素敏感性下降、血壓升高、動脈粥樣硬化等。本實驗中津力達和二甲雙胍干預后均不同程度地增加了血清脂聯素水平，可能在一定程度抑制了動脈粥樣硬化發生。

抵抗素存在于血漿中，是脂肪細胞分泌的富含半胱氨酸的多肽類激素［20］，國內外研究的焦點主要為其與肥胖、糖尿病之間的關系。抵抗素可能是肥胖和IR之間的重要鏈接，2型糖尿病的發生可能與抵抗素表達水平增高有關［21］。已有研究表明，抵抗素在人胰島中有表達［22］，抵抗素可以作用于胰島素信號轉導途徑，導致IR。但有關抵抗素對胰島分泌功能的研究尚未見報道。本實驗中津力達和二甲雙胍均能降低抵抗素水平，減輕IR。

FFA升高可以增加肝臟內源性葡萄糖生成，減少組織對葡萄糖的攝?。?3］，導致空腹血糖升高及高胰島素血癥，FFA在組織和血液中含量增加可以導致IR的形成，并在IR的發展中起著負面的作用。

本研究證明，高脂飲食成功誘導了IR大鼠模型，同時瘦素、胰島素、抵抗素和FFA含量升高，脂聯素濃度降低。說明高脂飲食使大鼠脂肪分解增加，FFA含量升高，干擾胰島素信號轉導，影響了糖脂代謝;同時，對糖脂代謝有正面調節作用的脂聯素水平下降，從另一方面影響了胰島素敏感性，最終導致IR。本實驗結果表明，津力達和二甲雙胍均能使高脂飲食對照組脂肪細胞因子的分泌趨于正常，間接證實了脂肪細胞因子分泌失調與IR的發生密切相關;并且，中成藥津力達的功效接近于二甲雙胍，能夠明顯降低瘦素、抵抗素和FFA水平，提高脂聯素水平，這可能是其改善IR的部分作用機制。

目前臨床治療IR主要應用雙胍類、格列酮類、降脂類藥物等。然而，這些藥物引起的不良反應，如乳酸性酸中毒、肝腎損害、肌肉疼痛等，導致部分患者不能耐受，從而不能夠長期堅持服用。我國傳統的中醫中藥在治療高脂血癥、IR等慢性疾病方面有著巨大的優勢和潛力。動物實驗顯示津力達與目前廣泛應用的治療藥物療效相當。當然，其療效及不良反應還需臨床試驗的進一步證實。

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