HPLC法測(cè)定小兒消食顆粒中熊果酸的含量

李華玉，林永強(qiáng)，郭東曉

（1.臨沂市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東臨沂276001；2.山東省食品藥品檢驗(yàn)所，山東濟(jì)南250101）

HPLC法測(cè)定小兒消食顆粒中熊果酸的含量

李華玉1，林永強(qiáng)2，郭東曉2

（1.臨沂市食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)中心，山東臨沂276001；2.山東省食品藥品檢驗(yàn)所，山東濟(jì)南250101）

目的采用高效液相色譜法測(cè)定小兒消食顆粒中熊果酸的含量。方法以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑，甲醇－0.5%醋酸銨溶液（83∶17）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm。結(jié)果熊果酸的進(jìn)樣量在0.168 6～3.372 0 μg之間與峰面積線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)r＝1.000 0，平均加樣回收率為96.5%（RSD＝0.59%，n＝6）。結(jié)論該方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確，可用于小兒消食顆粒中熊果酸的含量測(cè)定。

小兒消食顆粒；熊果酸；含量測(cè)定

1 儀器與試藥

1.1 儀器 Agilent 1200高效液相色譜儀；Sartorius CP225D電子天平。

1.2 試藥 熊果酸對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院提供，批號(hào)：110742－200517）；供試品批號(hào)為100801、110905、110906（規(guī)格1，產(chǎn)地山西，每袋裝1.5 g），1110002、1111001、1111002（規(guī)格2，產(chǎn)地山東，每袋裝1.2 g），由生產(chǎn)廠家提供，陰性對(duì)照為自制；甲醇為色譜純，水為Millipore制備的純化水，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 供試品溶液制備方法的考察

2.1.1 提取溶劑的考察 熊果酸極性較低，易溶于脂溶性較強(qiáng)的溶劑。參照《中國(guó)藥典》2010年版（一部）小兒消食片項(xiàng)下的提取條件，比較乙醚、二氯甲

烷、甲醇三種脂溶性溶劑的提取效果。結(jié)果測(cè)得每袋含量依次為0.76、0.66、0.76 mg。以二氯甲烷為提取溶劑時(shí)含量測(cè)定結(jié)果最低，其他兩種結(jié)果相當(dāng)。但是甲醇提取的供試品溶液放置后，有結(jié)晶析出，可能會(huì)影響色譜柱使用壽命，所以采用乙醚作為提取溶劑。

2.1.2 提取方法的考察 考察的提取方法包括：超聲處理（功率500W，頻率40 kHz）30、60、90 min，回流提取1、2 h。測(cè)得每袋含量依次為0.744、0.763、0.763、0.758、0.763 mg。由測(cè)定結(jié)果可知，超聲提取60、90 min與加熱回流提取2 h結(jié)果相當(dāng)。為了節(jié)省能源，確定提取方法為超聲提取60 min。

2.1.3 提取次數(shù)的考察 以乙醚作為提取溶劑，超聲提取60 min，對(duì)比了1次和2次提取的測(cè)定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)二者差距不大，結(jié)果分別為每袋0.763、0.764 mg。所以確定超聲提取1次即可。

2.1.4 取樣量的考察 考察三個(gè)取樣量（分別為1、2、3 g）對(duì)含量測(cè)定結(jié)果的影響。結(jié)果每袋含量分別為0.763、0.763、0.746 mg。取樣量1 g和2 g時(shí)測(cè)定結(jié)果差異不大，取樣量3 g時(shí)測(cè)定結(jié)果偏低。為了確保取樣的均勻性，確定規(guī)格2取樣量為2 g。由于規(guī)格1的處方量與規(guī)格2相同，制成總量是規(guī)格2的2.5倍，故規(guī)格1的取樣量定為5 g。

2012年11月 起，五建每隔三年開展一輪“情系千里，愛暖身邊”異地慰問(wèn)活動(dòng)，對(duì)分布于甘肅、陜西、四川、河南、吉林、上海等14個(gè)省市的離退休老同志進(jìn)行入戶和集中慰問(wèn)，累計(jì)行程5萬(wàn)余公里136個(gè)縣市地區(qū)。

2.2 供試品溶液的制備 取重量差異項(xiàng)下的樣品，研細(xì)，取規(guī)格1約5 g或規(guī)格2約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，加乙醚100 mL，超聲處理（功率500 W，頻率40 kHz）1 h，放冷，搖勻，濾過(guò)，濾渣用乙醚洗滌2次，每次25 mL，合并乙醚液，揮干，殘?jiān)檬兔眩?0～60℃）浸泡2次，每次10 mL（約浸泡1 min），傾去石油醚，殘?jiān)眉状既芙獠⑥D(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取熊果酸對(duì)照品15.08 mg，置25 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，精密量取5 mL，置25 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得到濃度為0.120 6 mg·mL－1的對(duì)照品溶液。

2.4 流動(dòng)相的考察 參考有關(guān)文獻(xiàn)［1～3］，選擇色譜柱Thermo BDS Hypersil C18（4.6mm×250mm，5μm），檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm，考察三種流動(dòng)相：甲醇－0.05%冰醋酸溶液（88∶12）、甲醇－0.05%冰醋酸溶液（83∶17）和甲醇－0.5%醋酸銨溶液（83∶17）。

精密吸取供試品溶液及對(duì)照品溶液各10μL，注入液相色譜儀，在三種流動(dòng)相下進(jìn)行測(cè)定，熊果酸色譜峰與相鄰峰分離度依次為1.35、1.45、1.77。故確定以甲醇－0.5%醋酸銨溶液（83∶17）作為流動(dòng)相。

2.5 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn) 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑；以甲醇－0.5%醋酸銨溶液（83∶17）為流動(dòng)相，流速1 mL·min－1；柱溫：35℃；檢測(cè)波長(zhǎng)為215 nm。理論板數(shù)按熊果酸峰計(jì)算應(yīng)不低于8 000。

2.6 耐用性試驗(yàn) 考察三種色譜柱：依利特Hypersil BDSC18（4.6 mm×250 mm，5μm）；Kromasil 100－5 C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；Thermo BDSHypersil C18（4.6 mm×250 mm，5μm）；按“2.5”項(xiàng)下確定的條件進(jìn)行試驗(yàn)。三種不同品牌的色譜柱分離度依次為1.81、1.60、1.77。結(jié)果表明，熊果酸色譜峰峰形較好，分離度均大于1.5，試驗(yàn)條件適用范圍廣。

2.7 線性關(guān)系的考察 分別精密吸取熊果酸對(duì)照品溶液（C對(duì)為0.168 6 mg·mL－1）1、2、5、10、15、20μL，注入液相色譜儀，分別測(cè)定峰面積。以熊果酸對(duì)照品的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線性回歸，得回歸方程，Y＝241.160 0X＋1.070 5（r＝1.000 0）。試驗(yàn)結(jié)果表明，熊果酸進(jìn)樣量在0.168 6～3.372 0μg之間進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系。

2.8 精密度試驗(yàn) 精密吸取熊果酸對(duì)照品溶液（0.168 6 mg·mL－1）10μL，注入液相色譜儀，連續(xù)進(jìn)樣6次，測(cè)其峰面積，RSD為0.19%，說(shuō)明儀器精密度良好。

2.9 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取批號(hào)為1111002（規(guī)格2）的樣品，照“2.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制成供試品溶液。每隔5 h進(jìn)樣一次，每次10μL，測(cè)定熊果酸峰面積，共考察25 h，計(jì)算，RSD為0.47%，結(jié)果表明供試品溶液在25 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.10 重復(fù)性試驗(yàn) 取批號(hào)為1111002（規(guī)格2）的樣品，照“2.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制成供試品溶液，平行制備6份，分別精密吸取供試品溶液10μL，注入液相色譜儀，測(cè)定，計(jì)算含量。結(jié)果平均含量為每袋0.759 3 mg（RSD為0.31%），說(shuō)明方法重復(fù)性良好。

2.11 加樣回收率試驗(yàn) 取批號(hào)為1111002（規(guī)格2，熊果酸含量為0.759 3 mg／袋，每袋裝1.2 g）的樣品約1 g，精密稱定，精密加入熊果酸對(duì)照品溶液（濃度為：0.674 4 mg·mL－1）1 mL及乙醚99 mL，按供試品溶液的制備方法平行制備6份，用上述色

譜條件進(jìn)行測(cè)定，計(jì)算回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

結(jié)果表明，測(cè)定方法的回收率良好。

2.12 專屬性試驗(yàn) 取處方中除去山楂的其他藥味，按處方比例制成缺山楂陰性對(duì)照樣品，照“2.3”項(xiàng)下供試品溶液的制備方法制得陰性對(duì)照溶液。分別精密吸取熊果酸對(duì)照品溶液、供試品溶液及陰性對(duì)照溶液各10μL，注入液相色譜儀進(jìn)行測(cè)定。結(jié)果供試品色譜中，在與對(duì)照品色譜保留時(shí)間相同的位置上，有相應(yīng)色譜峰，而陰性對(duì)照色譜中無(wú)相應(yīng)色譜峰。說(shuō)明處方中其他藥味對(duì)測(cè)定結(jié)果無(wú)干擾。結(jié)果見圖1。

圖1 專屬性試驗(yàn)HPLC色譜圖A.對(duì)照品；B.樣品；C.陰性對(duì)照

2.13 樣品含量測(cè)定 按供試品溶液的制備方法及上述色譜條件對(duì)6批樣品進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表2。

表2 熊果酸含量測(cè)定結(jié)果

3 討論

3.1 本實(shí)驗(yàn)中的供試品溶液，是參照《中國(guó)藥典》2010年版（一部）小兒消食片的提取條件進(jìn)行制備的，這有利于系列制劑標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)一。但是在后續(xù)的實(shí)驗(yàn)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，在《中國(guó)藥典》小兒消食片的HPLC條件下［流動(dòng)相為甲醇－0.05%冰醋酸溶液（88∶12）］，小兒消食顆粒供試品溶液中熊果酸的色譜峰未能達(dá)到合適的分離度，即使換用多種不同品牌的色譜柱，分離度始終低于1.5。采用流動(dòng)相［2～4］：甲醇－0.5%醋酸銨溶液（83∶17），熊果酸峰的分離效果好，對(duì)色譜柱選擇性不強(qiáng)。

3.2 同一中藥制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)不同，是當(dāng)前中藥檢驗(yàn)和質(zhì)量控制中遇到的一大問(wèn)題。本文建立的熊果酸含量測(cè)定方法，對(duì)分別執(zhí)行兩個(gè)不同標(biāo)準(zhǔn)的兩個(gè)生產(chǎn)廠家的小兒消食顆粒均適用，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的統(tǒng)一提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

［1］國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典2010年版（一部）［S］.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2010：493－494.

［2］李濤，郝武常，徐長(zhǎng)根，等.HPLC－ELSD法測(cè)定不同產(chǎn)地女貞子中齊墩果酸與熊果酸的含量［J］.中藥材，2005，28（5）：391－393.

［3］高文分，袁文娟.HPLC法測(cè)定毛萼香茶菜不同藥用部位中熊果酸和齊墩果酸的含量［J］.藥物分析雜志，2009，29（11）：1947－1949.

［4］梁瑞雪，張新軍，賈元印，等.HPLC法測(cè)定天中膠囊中刺囊酸和齊墩果酸的含量［J］.藥學(xué)研究，2013，32（11）：626－628.

Determination of usolic acid of Xiao′er Xiaoshi Granules by HPLC

LI Hua-yu1，LIN Yong-qiang2，GUO Dong-xiao2
（1．Linyi Center for Food and Drug Control，Linyi276001，China；2．Shandong Institute for Food and Drug Control，Jinan 250101，China）

ObjectiveTo establish an HPLC method for the determination of usolic acid in Xiao′er Xiaoshi Granules.MethodsC18column was adopted with methanol－0.5%ammonium acetate solution（83∶17）as mobile phase，and the detection wavelength was 215 nm.ResultsThe linear range of usolic acid was 0.168 6～3.372 0μg（r＝1.000 0）and the average recovery was 96.5%（RSD＝0.59%，n＝6）.ConclusionThe simple and accurate method can be used to determinate usolic acid of Xiao′er Xiaoshi Granules.

Xiao′er Xiaoshi Granules；Usolic acid；Determination

R927.2

A

2095－5375（2014）01－0011－003

2011年國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)提高課題（No.741）

李華玉，男，副主任藥師，研究方向：藥物分析，E－mail：820998279＠qq.com

郭東曉，男，博士研究生，研究方向：藥物分析，Tel：0531－81216523，E－mail：guodx0212＠126.com。