Dot-ELISA和RT-PCR檢測南方水稻黑條矮縮病毒靈敏度的比較

劉珊珊，周 倩，2，高必達，2，李有志，2，張政斌，郭海明

（1. 湖南農業大學植物保護學院，湖南 長沙 410128；2. 植物病蟲害生物學與防控湖南省重點實驗室，湖南 長沙 410128；3. 湖南省植保植檢站，湖南 長沙 410005）

南方水稻黑條矮縮病毒（Sou thern rice b lackstreaked dwarf virus，SRBSDV）引起的水稻病害由華南農業大學周國輝教授于2001在廣東省首次發現，2008年被鑒定為斐濟病毒屬中一暫定新種[1]。該病毒主要通過白背飛虱傳播，危害水稻，玉米、小麥等禾本科作物和一些田間雜草。最近幾年由SRBSDV引起的水稻矮縮病在我國南方和越南發生嚴重。2009年湖南、江西等九省受害面積達到數千公頃，2010年，發病范圍擴大至西南及長江中下游部分單季稻區，江淮局部地區也檢測到感病植株，且感病程度逐年加重，由零星田塊分布轉為連片分布，個別田塊甚至絕收[2]。2011、2012年全國南方黑條矮縮病發生程度比前幾年低，但發生地區更集中[3]。南方水稻黑條矮縮病一旦發生，目前沒有有效的治療藥劑，因此病害的預測預報對病害防治至關重要。檢測白背飛虱、田間雜草和水稻植株的帶毒率是病害預測預報的基礎。

目前檢測病毒常用的方法大致分為分子檢測技術和血清學檢測技術兩類。分子檢測技術是一種基于核酸水平的檢測，具有準確高效、靈敏快速的特點，但操作比較復雜，成本高。血清學檢測技術是以抗原抗體特異性反應為基礎的檢測技術，具有快速靈敏經濟的特點，并且操作簡單，但如果抗體非特異性結合容易造成假陽性[4-7]。為了尋找一種適合SRBSDV大量樣本檢測的方法，比較了RT-PCR和Dot-ELISA兩種檢測方法的靈敏度，以期為基層植保人員檢測SRBSDV提供參考。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 植物材料 2012年湖南省郴州北湖區經檢測感染SRBSDV的水稻植株。

1.1.2 介體材料 室內人工飼毒的白背飛虱群體，經過RT-PCR方法檢測獲得帶毒蟲汁液及RNA。

1.1.3 試 劑 南方水稻黑條矮縮病毒（SRBSDV）Dot-ELISA試劑盒（農業部農技技推廣中心），Trizol（TaKaRa），5×first stand buffer ，M-M LV反轉錄酶（均購自Invitrogen），Taq DNA聚合酶，dNTP，10×PCRbu ffer，DNase/RNase-Free去離子水（天根生化科技有限公司），GoldenVieⅡ（Solarbio）隨機引物（上海生物工程技術服務有限公司），Trans2K DNA Marker，Trans2K Plus II DNA Marker（北京全式金生物技術有限公司），特異性引物：S10F為5'-TTAAGTTTATTCGCAACTTCGAAG-3'，S10R為5'-GTGATTTGTCAGCATCTAAAGCG-3'[8]。

1.2 方 法

1.2.1 樣品處理 植物材料：取1 g患病水稻莖稈于液氮中反復研磨至粉末狀，部分粉末轉移至2支離心管，分別稱重，再進行RT-PCR和Dot-ELISA檢測。

介體材料：取單頭白背飛虱于離心管中，加20 μL的PBS研磨， 5 000 g離心3 m in后，分別取10 μL研磨液于新離心管，分別進行RT-PCR和dot-ELISA檢測。

1.2.2 RT-PCR檢測 （1）總RNA提取。向上述樣品處理物中加入1 m L Trizol，渦旋器上振蕩混勻。然后加入500 μL的氯仿/異戊醇（24∶1），混勻，冰浴靜置10 m in。4℃ 12 000 g 離心15 m in，取上層水相，轉移至另一新離心管。加入等體積異丙醇，混勻， 冰浴放置30 m in，4℃ 12 000 g 離心10 m in，棄上清，加入1 m L 70%乙醇，懸浮沉淀，4℃ 7 500 g 離心5 m in，盡量棄上清。加入1 m L無水乙醇，懸浮沉淀，4℃ 7 500 g 離心5 m in，盡量棄上清。室溫或真空干燥1 m in，加入30 μL DNase/RNase-Free去離子水，－20℃保存備用（白背飛虱研磨液加200 μL Trizol和100 μL的氯仿/異戊醇抽提，其余步驟相同，沉淀最后溶于10 μL DNase/RNase-Free去離子水）。

（2）植物材料RNA稀釋。取1 μL總RNA用DNase/RNase-Free去離子水進行5倍、10倍、20倍、100倍、1 000倍、5 000倍稀釋。

（3）白背飛虱RNA稀釋。取1 μL總RNA用DNase/RNase-Free去離子水進行5倍、10倍、20倍、50倍、100倍、500倍、1 000倍、5 000倍稀釋。

（4）反轉錄。反應總體積20 μL，分別加入DNase/RNase-Free去離子水9 μL，隨機引物1 μL，上述經稀釋的RNA樣品3 μL，65℃水浴5 m in，立即冰上孵育5 m in， 繼續加入5×first stand buffer 4 μL， dNTP（10 mmol/L）2 μL，M-MLV反轉錄酶（200 U/μL）1 μL，在42℃水浴1 h，得到cDNA。

（5）PCR擴增：反應總體積25 μL，DNase/RNase-Free去離子水17.5 μL，10×PCR buffer 2 μL，dNTP（10 mmol/L） 0.5 μL，S10F（10 μ mol/L） 1 μL ， S10R（10 μ m ol/L） 1 μL，TaqDNA聚合酶（2.0 U）0.5 μL，cDNA 2 μL。擴增程序為首先95℃預變性5 m in，然后95℃變性30 s，55℃退火30 s，72℃ 延伸45 s，35個循環，最后72℃延伸10 m in。反應結束后，取8 μL反應產物，經1.0%瓊脂糖凝膠電泳，Golden View Ⅱ染色，在凝膠成像系統中觀察照相。

1.2.3 Dot-ELISA檢測 （1）樣品的制備與稀釋。取上述植物材料樣品處理物，加入5.2 m L的PBS（PBS按試劑盒說明書 樣品∶PBS = 1 g∶20 m L 加入），裝入離心管，5 000 g， 離心3 m in。取上清液做為原液，用PBS進行5×、10×、20×、100×、1 000×、5 000×稀釋；取白背飛虱樣品處理物用PBS進行5×、10×、20×、50×、100×、500×、1 000×、5 000×稀釋。

（2）點樣。用鑷子取一張NC膜放置干凈的培養皿內，分別取2 μL原液及稀釋后的液體輕點到NC膜上，每個樣品更換槍頭。

（3）干燥。樣品點膜完成后在室溫下干燥10～20 m in。

（4）封閉。先往干凈的空培養皿中加入1 g脫脂奶粉，然后加入2 m L 10×濃縮封閉液和18 m L去離子水，用槍頭抽吸混勻，再把NC膜放入稀釋好的封閉液中，搖床上室溫封閉30 m in。

（5）一抗孵育。依次往干凈的空培養皿中加入1 g脫脂奶粉，2 m L 10×濃縮抗體稀釋液和18 m L去離子水，槍頭抽吸混勻后加入10 μL SRBSDV單克隆抗體，再晃動混勻，放入NC膜，搖床上室溫孵育30～60 m in。

（6）洗滌。用去離子水將20×濃縮洗滌液稀釋成1×洗滌液（即1 m L20×濃縮洗滌液+19 m L去離子水），取20～30 m L洗滌液至空培養皿中，放入NC膜，輕輕晃動洗滌，每次3 m in，共4次。

（7）二抗孵育。依次往干凈的空培養皿中加入1 g脫脂奶粉，2 m L 10×濃縮抗體稀釋液和18 m L去離子水，槍頭抽吸混勻，然后加入3 μL AP標記羊抗鼠IgG二抗（白背飛虱樣品處理物加入10 μL HRP標記羊抗鼠IgG二抗），再晃動混勻，放入NC膜，搖床上室溫孵育30~60 m in。

（8）洗滌。取20~30 m L洗滌液至空培養皿中，放入NC膜，輕輕晃動洗滌，每次3 m in，共5次；

（9）顯色底物液配制。在一個干凈的培養皿中依次加入10 m L底物緩沖液，66 μL NBT和33 μL BCIP，晃動混勻。

（10）顯色及終止。將洗好的NC膜用濾紙吸干后放入上述顯色底物液中避光顯色，待陽性對照顯色明顯，而陰性對照沒有任何顯色時終止反應，即在自來水中漂洗一下，洗去底物，肉眼觀察結果，并記錄（白背飛虱樣品處理物加入2 m L TMB顯色液直接顯色）。

2 結果與分析

2.1 帶毒水稻的檢測

RT-PCR檢測方法最終可以檢測到RNA的最大稀釋倍數為原液的1 000×（結果見圖1）。稱取的植物材料樣品處理物0.261 g，提取的總RNA，溶于DNase/RNase-Free去離子水，取1/10 的RNA做20 μL反應體系的RTPCR，再從中取1/10的RT產物做25 μL反應體系為的PCR，最后取8/25的反應液跑膠。檢測到稀釋1 000×的RNA，通過計算得出能被檢測的最小感病組織重量為0.83 μg。

Dot-ELISA檢測方法最終可以檢測到的最大稀釋倍數為原液的20×（結果見圖2）。稱取的植物材料樣品為0.265 g，按試劑盒要求加入5.3 m L PBS，經梯度稀釋，分別取2 μL 點樣在NC膜上，經計算得出原液樣品組織重量為100 μg。最終能被檢測的最小感病組織重量為5.0 μg。

圖1 RT-PCR技術檢測帶毒水稻Fig.1 Detection of diseased rice plants by RT-PCR

圖2 Do t-ELISA技術檢測帶毒水稻Fig.2 Detection of diseased rice p lants by Dot-ELISA

2.2 帶毒白背飛虱的檢測

取單頭白背飛虱于離心管中，加20 μL的PBS研磨，5 000 g 離心3 m in后，分別取10 μL研磨液于新離心管，進行RT-PCR和Dot-ELISA檢測。采用RT-PCR技術檢測方法最終可以檢測到的最大稀釋倍數為原液的100倍（結果見圖3），Dot-ELISA檢測方法結果能檢測到原液（結果見圖4）。

3 討 論

分別用RT-PCR和Dot-ELISA檢測感病水稻和帶毒飛虱并比較了兩種檢測方法的靈敏度，兩種方法所檢測材料來自同一株水稻和同一頭白背飛虱，結果具有可比性。試驗結果表明，RT-PCR檢測技術比Dot-ELISA檢測技術更靈敏。Dot-ELISA技術檢測結果容易受到溫度、顯色時間長短的影響，樣品內的一些成分，如蛋白質、內源性酶、葉綠素等也會干擾檢測結果，導致其靈敏性比RT-PCR技術低[9-11]。然而，Dot-ELISA檢測技術在檢測樣品原液時，其檢測結果和RT-PCR檢測技術的檢測結果具有一致性，由于其操作較RT-PCR技術簡

圖3 RT-PCR技術檢測帶毒白背飛虱Fig.3 Detection of diseased white-backed planthopper by RT-PCR

圖4 Do t-ELISA技術檢測白背飛虱Fig.4 Detection of diseased white-backed p lanthopper by Dot-ELISA

單，適用于大規模樣品的檢測。在做南方水稻黑條矮縮病的預測預報時往往需要大量檢測白背飛虱帶毒率，判斷病害發展情況，Dot-ELISA技術可以通過擴大NC膜的面積來增大檢測樣品的數目，更簡便、經濟、快速。對于水稻植株的檢測，由于SRBSDV與RBSDV的CP蛋白的氨基酸序列同源性很高，Dot-ELISA技術在檢測感病水稻時無法區別南方水稻黑條矮縮病和水稻黑條矮縮病[12]，而RT-PCR技術基于高度特異性的引物可以區別二者[13]。因此，建議在檢測感病植株時采用RT-PCR檢測技術，檢測白背飛虱則選擇Dot-ELISA技術。

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