HPLC-ELSD測定得力生注射液的黃芪甲苷的含量

羅丹，羅國安，陳麗，馬晉芳，王義明

得力生注射液是抗腫瘤藥物，是由紅參、黃芪、蟾酥和斑蝥4味中藥組成的復方靜脈注射液，具有益氣化瘀、軟堅散結之功效，能促進腫瘤細胞凋亡及再分化，抑制多種腫瘤細胞生長，對放療和化療不敏感的腺型癌細胞也有很強的抑制作用和顯著的鎮痛作用，還可清除體內自由基，顯著提高機體的免疫功能[1,2]。

關于得力生注射液質量標準的研究，目前僅見關于其中華蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量的相關報道[3]。然而，國家藥品監督管理局頒布的《中藥注射劑安全性再評價質量控制評價技術原則（試行）》中明確規定：“多成份制成的注射劑應分別采用專屬性的方法（如HPLC和/或GC等定量方法）測定各主要結構類型成份中至少一種代表性成份的含量，其中含量測定指標成分的選擇應包括大類成分和單一成分的含量測定。在對得力生注射液質量標準的系統研究中，我們已建立了得力生注射液中單糖及蔗糖含量的測定方法[4]。得力生注射液中配伍藥材黃芪具有補氣升陽，固表止汗，利水消腫，生津養血等功效，為扶正補虛之要藥，現代研究表明，黃芪中主要活性成分黃芪甲苷具有調節機體免疫功能、保護腎上腺皮質和骨髓功能的效應[5,6]。本文用HPLCELSD建立了得力生注射液中黃芪甲苷的含量測定方法，為產品質量的提高提供參考。

1 儀器與試藥

Agilent 1100系列高效液相色譜儀（配備二元泵，柱溫箱等；Agilent公司）；Alltech2000蒸發光散射檢測器（Alltech公司），浙江大學N2000色譜工作站；超純水儀（Milli-Q Synthesis超純水純化系統）；XP205型電子天平（d=0.01mg；瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-500E 型超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司，功500W，頻率40KHz)。

乙腈（色譜純，fisher公司）， 超純水（Milli Q Synthesis 超純水純化系統制， 過0.2μm 微孔濾膜）；正丁醇、氨水、乙醇等其他試劑均為分析純；D101型大孔吸附樹脂（天津海光化工有限公司生產）。

黃芪甲苷對照品（中國藥品生物制品檢定所，批號為110808-200508，含量測定用，純度大于98%）。得力生注射液模型制劑按工藝制備，得力生注射液（批號：101101，101102，101103）及各配伍藥材均由山東正邦制藥有限公司提供。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Alltech AlltimaC18（4.6×250 mm, 5 μm）；流動相：乙腈-水（32∶68）；流速：1 mL．min-1；柱溫：30℃；蒸發光散射檢測器（干燥氣流速2.7 L．min-1；漂移管溫度100℃）；進樣量：20 μL。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 取黃芪甲苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含1.3 mg的溶液，即得。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密量取得力生注射液100 mL，通過D101型大孔吸附樹脂柱（內徑為1.5 cm，柱高為12 cm），以水50 mL洗脫，棄去水液，再用40%乙醇30 mL洗脫，棄去洗脫液，繼用95%乙醇100 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉移至5 mL量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，用微孔濾膜0.45 μm濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液的制備 按處方量制備缺黃芪藥材的得力生注射液樣品，按“2.2.2”項下制備成陰性對照液。

2.3 干擾實驗

精密吸取黃芪甲苷對照品溶液、得力生注射液供試品溶液、陰性對照液各20 μL，分別注入液相色譜儀，在“2.1”色譜條件下測定，記錄色譜圖（見圖1）。在得力生注射液供試液色譜圖中，與對照品色譜圖相應位置（tR=26.0 min）上，確認了黃芪甲苷色譜峰，而陰性對照液色譜圖無黃芪甲苷的色譜峰，故認為無干擾。

圖1 高效液相色譜圖A.標準品；B.藥材；C.提取液；D.注射液；1.黃芪甲苷

2.4 線性關系考察

將“2.2.1”黃芪甲苷對照品配制成質量濃度分別為0.065 mg．mL-1，0.262 mg．mL-1，0.524 mg．mL-1，0.786 mg．mL-1，1.048 mg．mL-1，1.310 mg．mL-1的系列濃度對照品溶液，在“2.1”色譜條件下測定，以對照品質量濃度（mg．mL-1）的對數為橫坐標（X），峰面積為縱坐標（Y）繪制標準曲線，回歸方程為Y=1.5615X+4.5659，相關系數：r=0.9993（n=6），表明在0.065～1.310 mg．mL-1之間呈良好的線性關系。

2.5 最低定量限及檢測限

采用信噪比法檢測黃芪甲苷的檢測限及定量限。以信噪比為3∶1時相應濃度確定其檢測限，以信噪比為10∶1時相應濃度確定其定量限。將黃芪甲苷對照品溶液稀釋一定倍數，分別自動進樣20 μL，得到黃芪甲苷的檢出限及定量限。檢測限為：0.434 μg。定量限為：1.300 μg。

2.6 精密度實驗

精密吸取黃芪甲苷對照品溶液，按“2.1”色譜條件連續測定6次， 記錄峰面積，測得黃芪甲苷的精密度（RSD）為0.14%，表明精密度良好。

2.7 重復性實驗

精密量取得力生注射液，按“2.2.2”供試品溶液的制備方法制備6份得力生注射液供試品溶液，按“2.1”色譜條件依次測定，記錄色譜峰峰面積，測得黃芪甲苷峰面積的RSD為3.47%（n=6），結果表明方法重現性良好。

2.8 穩定性實驗

分別精密吸取室溫下放置的得力生注射液供試品溶液，分別在配制后0，2，4，6，8和12 h，按“2.1”色譜條件進樣分析，測定黃芪甲苷峰面積，計算RSD為3.12%。結果表明，供試品溶液在12 h內穩定性良好。

2.9 加樣回收率實驗

精密量取已知含量的得力生注射液50 mL，共9份，按80%，100%，150% 3個目標濃度，分別精密加入黃芪甲苷對照品適量，每一質量濃度取3份，按“2.2.2”項下制備供試品溶液，按“2.1”色譜條件測定，計算平均回收率為100.1%，RSD為3.7%。結果見表1。

表1 回收率實驗結果 (n=9)

2.10 樣品測定

取3批得力生注射液供試品溶液各20 μL，采用“2.1”色譜條件進樣分析，測定黃芪甲苷的含量。結果表明，3批得力生注射液（批號101101，101102，101103）中黃芪甲苷的含量分別為12.84 μg．mL-1、12.58 μg．mL-1、16.12 μg．mL-1。

3 討論

黃芪甲苷為得力生注射液中黃芪扶正祛邪，調節機體免疫功能的主要活性成分。本研究建立了該成分含量測定方法，方法簡便、準確、靈敏度高，能夠有效控制該制劑質量。

鑒于黃芪甲苷的紫外最大吸收波長在200 nm ，屬有末端吸收[8]，故本研究采用HPLC-ELSD測定黃芪甲苷的含量。通過對蒸發光檢測器溫度和載氣流量等考察，當檢測器溫度100℃；載氣流量：2.7 L．mL-1黃芪皂苷的響應值較好，并且有較好的分離度。同時對不同流動相體系甲醇-水、乙腈-水，及不同流動相比例進行考察，確定乙腈-水（32∶68）為流動相具有較好的分離度。

由于得力生注射液由紅參、黃芪、蟾酥和斑蝥四味藥材提取物制成，干擾成分較多。目前尚未見得力生注射液中黃芪甲苷的含量測定方法。本研究對黃芪甲苷的富集方法進行優化。采用大孔樹脂法、水飽和正丁醇萃取法和SPE固相萃取法分別制備供試品溶液，結果表明，3種方法測定結果均無統計學差異。在獲得較好實驗結果的前提下，考慮到方法重現性、檢測成本等因素，最終采用大孔吸附樹脂法富集得力生注射液中黃芪甲苷。對大孔樹脂類型和洗脫梯度進行考察，確定D101型大孔吸附樹脂柱，以水50 mL洗脫，棄去水液，再用40%乙醇30 mL洗脫，棄去洗脫液，繼用95%乙醇100 mL洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘渣加甲醇溶解。這一前處理方法可有效去除極性成分，糖類等的干擾，實現黃芪甲苷準確定量。

[1] 劉建新,路華,張玉珍,等.得力生聯合化療的體外抗癌活性[J].河北醫科大學學報, 2001, 22(5): 294.

[2] 孫建海,馬燕凌,彭明娥.化學治療聯合得力生注射液治療中晚期惡性腫瘤102例[J].醫藥導報, 2006, 25(6): 523.

[3] 高祥祥,張文婷,李秀玲,等.HPLC測定得力生注射液中華蟾酥毒基和酯蟾毒配基含量[J].2006,11(28): 1709.

[4] 馬晉芳,陳麗,謝媛媛,等. HPLC-ELSD同時測定得力生注射液中單糖及蔗糖含量[J].藥物分析雜志,2012, 32(6): 998.

[5] 牛嵩山.黃芪甲苷的藥理研究進展[J].國醫論壇, 2012, 27(4): 53.[6] 陳信義,雒琳.得力生注射液組方科學依據與臨床應用前景分析[J].現代腫瘤醫學,2006,14(37):378.