對氧磷酶1基因Gln/Arg192多態性與氯吡格雷抵抗相關性初步研究

曹桂花，王 偉，毛永敏

（1.天津醫科大學研究生院，天津300070；2.天津市胸科醫院心內科，天津300050；3.天津市胸科醫院心血管病研究所，天津300051）

氯吡格雷（clopidogrel）是繼阿司匹林之后一個重要的噻吩并吡啶類抗血小板藥物,也是目前經皮冠狀動脈介入治療（percutaneous coronary intervention,PCI）后的常規用藥，阿司匹林和氯吡格雷雙抗治療是減輕PCI過程中血小板聚集的金標準[1]，且可明顯降低術后心血管不良事件的再發率[2]，但臨床中應用氯吡格雷時仍有4%～30%的患者在常規劑量治療中達不到預期的抗血小板作用，嚴重者會導致血栓、再次心肌梗死、死亡等心血管不良事件，稱為氯吡格雷抵抗（clopidogrel resistance,CR）[3]，CR的發病機制目前尚不十分明確，基因的多態性是引起氯吡格雷抵抗的重要因素之一。本研究對天津市部分人群PON-1基因Gln/Arg192多態性進行分析，探索PON-1基因Gln/Arg192多態性與PCI術后CR發生的相關性，以為早期預測CR及CR患者個體化治療提供幫助。

1 資料和方法

1.1 研究對象 本研究所選的對象為2010年11月-2013年5月在天津市胸科醫院心內科接受住院治療并行PCI手術的冠心病患者，共260例。入選標準：年滿20歲；經冠脈造影診斷為冠心病；給予標準雙聯抗血小板治療（阿司匹林和氯吡格雷），口服阿司匹林（300mg）及氯吡格雷（300mg）24h以上或口服阿司匹林（每日100mg）及氯吡格雷（每日75mg）4d以上。排除標準：2周內服用氯吡格雷或噻氯匹啶者；具有對阿司匹林及氯吡格雷過敏者；對阿司匹林及氯吡格雷有禁忌證者；凝血功能障礙者；患急慢性血液系統疾病或血小板計數<10萬；6個月內有卒中或出血性疾病病史者；伴有嚴重的肝腎功能損害或合并感染、腫瘤或免疫系統疾病；近期擬行外科手術者。

1.2 分組 使用氯吡格雷后最大血小板聚集與基線值的差值<10%定義為CR，據此將PCI手術治療的冠心病患者分為CR組和非氯吡格雷抵抗（NCR）組。1.3冠心病易患因素采集及生化指標的測定 所有受試者住院時記錄性別、年齡、體質量、吸煙史、飲酒史、糖尿病史及高血壓病病史。采集空腹12h后的靜脈血5mL，應用德國MERCK全自動生化分析儀測定TC、TG、HDL C及LDL C水平。

1.4 PON-1基因Gln/Arg192多態性測定 采集空腹12h的靜脈血5mL，EDTA抗凝，以低滲溶血法提取細胞基因組DNA,-20℃冰箱保存。PCR引物：由上海生物工程技術服務有限公司合成，上游：5′-TAT TGT TGC TGT GGG ACC TGA G-3′，下游：5′-CAC ATA CTT GCC ATC GGG TAG A-3′；PCR反應體系為：25μL反應體系：模板DNA 0.5μL、dNTP0.5μL、BufferC 5μL、Taq聚合酶 0.25μL、Primers P10.5μL、Primers P20.5μL、H2O 17.75μL，混勻、離心。PCR反應條件：95℃預變性5min，三步循環；變性96℃30s，退火60℃30s，延伸72℃60s，35個循環后72℃再延伸7min。擴增產物用2%瓊脂糖凝膠電泳40min，EB染色，紫外燈下可見擴增得到的199bp片段。PCR產物12μL，限制性內切酶Hinf I 1μL，10×BufferR1.8μL，H2O 3.2μL，混勻后離心30s，37℃電熱恒水溫箱孵育過夜，3%瓊脂糖凝膠電泳50min，EB染色，紫外線燈下判斷基因型: RR純合子（77bp和34bp），QR雜合子（111bp、77bp和34bp），QQ純合子（34bp）。

1.5 統計學處理 采用SPSS17.0統計學軟件處理，計量資料以±s表示，兩組間比較采用t檢驗；基因型、等位基因頻率和組間計數資料的比較采用χ2檢驗；基因與事件關聯強度以比值（OR）及95%可信區間（95%CI）表示；P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 一般臨床資料 實驗室檢查結果符合CR診斷標準者共54例（20.8%）。研究對象基本資料見表1。兩組患者的性別、年齡、體質量指數等一般資料差異無統計學意義（P>0.05），常規實驗室檢查結果差異無統計學意義（P>0.05）。

表1 CR組和NCR組臨床基本資料比較Tab 1 Comparison on basic clinical data of both CR and NCR groups

2.2 PON-1基因Gln/Arg192等位基因及基因型的分布 PON-1基因Gln/Arg 192等位基因分布為：Q等位基因頻率在CR組與NCR組分別30.6%及34.7%；R等位基因頻率在兩組間分別為69.4%及65.3%，基因型分布見表2。

表2 PON-1基因Gln/Arg192位點基因型及等位基因頻率分布[n（%）]Tab 2 The genotype and allele frequency of PON-1gene Gln/ Arg192in CR group and NCR group[n（%）]

統計分析顯示，兩組人群PON-1基因Gln/ Arg192位點基因型分布符合Hardy-Weinberg平衡。各基因型在CR組和NCR組間分布頻率差異無統計學意義（χ2=1.358，P=0.507）；R、Q等位基因在CR組及NCR組間差異也無統計學意義（χ2=1.588，P=0.208）。分析校正基因型RR/QR（OR=0.674，95% CI=0.346～1.313，P＝0.246） 及 RR/QQ（OR= 0.762，95%CI=0.236～1.911，P=0.456）差異無統計學意義后，發現PON-1基因Gln/Arg 192位點基因多態性與冠心病患者CR的發生無相關關系。

3 討論

血小板激活在急性冠脈綜合征（ACS）的發病中起著重要的作用[5]，抗血小板治療抑制血小板的粘附、聚集和釋放，從而阻止血栓形成。氯吡格雷是一種新型噻吩并吡啶類衍生物，是通過體內代謝才能產生具有抗凝血活性代謝物的前體藥物[6]，氯吡格雷的活性代謝產物選擇性的、不可逆的與血小板膜表面一種ADP受體（P2Y12受體）結合,阻斷ADP對腺苷酸環化酶的抑制作用,起到抑制血小板聚集的作用[7]，與阿司匹林聯用，可使ACS的危險性大大減低，還可以有效減少PCI術后的支架內血栓形成。目前，CR機制尚不完全清楚，大量研究證實，CR與遺傳基因多態性、藥物動力學和血小板特性等有關，ACS時劑量不足和藥物相互作用以及人體質量指數等也與CR相關[8-9]，除這些因素，CR還和糖尿病、年齡、肥胖、性別（女性）相關[10]；Wiviott等認為分子遺傳學機制在CR的內因中起著很重要的作用。關于 CR的研究多集中在 CYP450酶系[11-12]及P2Y12基因多態性[13]，而Bouman等[4]在歐美人群中利用體外代謝譜技術，發現PON-1基因是氯吡格雷生物活化的一種關鍵酶，PON-1基因定位于染色體7q21.3～q22.1區，由355個氨基酸殘基組成，PON-1基因有近200個SNP位點[14]，其中兩個位于編碼區的重要多態位點分別是第55位點的Leu-Met和第192位點的Gln-Arg[15]。在國外，Bouman等[4]實驗結果表明：PON-1QQ192純合子個體相比RR192純合子個體有較高支架內血栓形成的風險、較低的活性代謝產物濃度和較低的血小板抑制，從而認為PON-1基因Gln/Arg192多態性是影響氯吡格雷生物活化和臨床活性的主要因素；隨后，Sibbing等[16]通過對1524例經PCI治療患者的研究認為：PON-1基因Gln/Arg192多態性與氯吡格雷的療效無相關。在國內，關于PON-1基因Gln/Arg192多態性與患者PCI術后CR發生相關性研究罕見報道，因此我們選取PON-1基因Gln/Arg192多態性進行研究，探討天津市部分人群PON-1基因Gln/Arg192多態性是否與冠心病患者PCI術后CR發生存在相關性，為早期預測CR提供可能性。本研究發現，CR組和NCR組中PON-1基因Gln/Arg192基因型頻率和等位基因分布頻率在兩組間分布無統計學差異（P＞0.05）。結果提示天津市部分人群PON-1基因Gln/Arg192多態性與CR的發生并不存在明顯相關性，表明PON-1基因Gln/Arg192分型尚不足以作為CAD患者PCI術后進行早期預測氯吡格雷抵抗的指標。本研究樣本例數偏少，其結果能否證實PON-1基因Gln/Arg192分型與CR無相關仍需擴大樣本量進一步證實。

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