炎癥因子IL-23對黑色素瘤B16F10細胞增殖和侵襲能力的影響

田 原，馬躍美，劉艷榮，房東亮，趙秀蘭

（天津醫科大學1.外科手術學教研室；2.病理學教研室，天津300070）

白細胞介素-23（IL-23）在炎癥和自身免疫性疾病中具有重要的調節作用，目前研究表明IL-23可通過調控腫瘤微環境中的炎癥反應[1]，從而促進腫瘤的發生與侵襲遷移[2]。有關炎癥因子IL-23對黑色素瘤細胞增殖和侵襲力的直接影響少見報道。本研究在前期研究慢性炎癥與腫瘤關系的基礎上，通過體外實驗探討IL-23對黑色素瘤B16細胞增殖和侵襲能力的影響，為進一步研究IL-23在慢性炎癥與腫瘤發生發展中所發揮的作用提供一定理論依據。

1 材料與方法

1.1 材料 小鼠黑色素瘤細胞株B16F10由天津醫科大學病理學教研室凍存。重組鼠IL-23購自美國PeproTech公司，Transwell小室（直徑為 8μm）購自Invitrogen公司，MTT購自美國Sigma公司，Matrigel膠購自美國BD公司，細胞培養板購自美國Costar公司，胎牛血清（FBS）購自美國Hyclone公司。兔抗鼠NF-κB磷酸化P65一抗購自美國Santa Cruze公司，兔抗鼠β-actin一抗、山羊抗兔二抗購自北京中杉金橋生物公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養 小鼠黑色素瘤細胞B16F10，接種于含10%胎牛血清的RPMI-1640培養基中（加入青霉素、鏈霉素各100 U/m L），置于37℃、5%CO2培養箱中培養，以0.25%胰蛋白酶消化傳代。所有實驗均用對數生長期的細胞。

1.2.2 MTT法檢測B16細胞的增殖能力 將B16細胞制備成1×104/mL單細胞懸液，按每孔200μL接種于96孔培養板，培養24 h后在培養液中加入終濃度為10 ng/mL的IL-23，并設空白對照組，在培養箱中分別放置24、48、72、96 h后，加入MTT 100 μL培養4 h，吸棄液體，每孔加入100μLDMSO充分溶解15min。用酶標儀于490 nm處測吸光度值(A值)，結果為5復孔的平均值。

1.2.3 Transwell侵襲實驗檢測B16細胞的侵襲能力 用 50 mg/LMatrigel膠 1∶8稀釋液包被 Transwell小室的上室面，37℃孵育過夜。實驗前細胞用無血清培養基培養過夜，次日消化重懸細胞，于下室加入含10%胎牛血清的培養基、上室中加入無血清和濃度為10 ng/mL IL-23的B16細胞懸液各200 μL，并設空白對照組，在培養箱中培養48 h后取出小室，PBS淋洗，擦去上室中細胞，95%酒精固定10 min，4 g/L結晶紫染色，PBS清洗，200倍倒置顯微鏡下拍照穿膜細胞，隨機選10個視野，計算平均數。實驗重復3次，每組各設3復孔。

1.2.4 明膠酶譜檢測B16細胞MMP-2和MMP-9的表達活性 將無血清的B16細胞接種到24孔板，每孔500μL，培養24 h后，在培養液中加入10 ng/mL IL-23，培養48 h后，收集上清液，12 000 r/min，離心10min，進一步取上清液進行明膠酶譜檢測。以含0.1%明膠的10%聚丙烯酰胺凝膠進行電泳至溴酚蘭進入陽極緩沖液為止，分離凝膠，2.5%Triton-X100洗膠4次，每次30min。將膠完全浸入明膠酶孵育液（50mmol/L pH7.5Tris-HCl、10mmol/L CaCl2、200mol/LNaCl、1 μmol/LZnCl2）中，37 ℃孵育42 h，常規考馬斯亮藍染色，脫色液脫色至復染帶清晰，圖像分析系統測定凝膠中MMPs活性條帶活性水平，應用Gel-pro analyzer分析軟件測定條帶平均灰度值。

1.2.5 Western blot檢測 加入細胞裂解液裂解細胞，提取細胞總蛋白，加樣行10%聚丙烯酰胺凝膠電泳。將蛋白從SDS-PAGE膠轉膜至PVDF膜，利用5%脫脂奶粉封閉，然后分別加入兔抗鼠NF-κB磷酸化 P65 一抗（1∶200）、β-actin 一抗（1∶200），在37℃下作用2 h；用TBST漂洗3次，每次10min后與山羊抗兔 IgG 抗體（1∶2 000）反應，37℃作用 2 h；然后用TBST漂洗，10min/次，洗滌3次；在暗室避光X光膠片曝光，進行顯影、定影、拍照。

1.3 統計學處理 實驗數據以均數±標準差 （x±s）表示，采用SPSS 17.0軟件做統計分析，兩獨立樣本比較采用t檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2.1 IL-23對B16細胞增殖能力的影響 MTT法檢測結果顯示，10 ng/mL IL-23作用于B16細胞24、48、72和96 h時，實驗組與對照組相比，細胞活力均無顯著變化，IL-23對細胞的增殖無影響，差異無統計學意義（P>0.05）（圖 1）。

圖1 IL-23對B16細胞增殖能力的影響Fig 1 Theeffectof IL-23 on proliferation ability of B16 cells

2.2 IL-23對B16細胞侵襲能力的影響 Transwell侵襲實驗顯示，10 ng/mL IL-23作用于B16細胞24 h后，與對照組相比，穿過基底膜的數目明顯增多，差異有統計學意義（P<0.01）（表 1）。

表1 IL-23對B16細胞侵襲能力的影響（x±s）Tab1 Effectof IL-23 on invision ability of B16 cells（x±s）

2.3 IL-23對B16細胞MMP-2和MMP-9表達活性的影響 與對照組相比，10 ng/mL IL-23作用于B16細胞48 h后，可明顯增強腫瘤細胞MMP-9活性，差異有統計學意義（P<0.01），MMP-2活性未見顯著變化（P>0.05）（圖 2）。

2.4 IL-23對B16細胞磷酸化NF-κB P65表達水平的影響 Western blot結果與對照組相比，IL-23處理組腫瘤細胞磷酸化P65蛋白表達水平顯著升高（P<0.01），見圖 3。

圖2 IL-23對B16細胞MMP-9和MMP-2表達活性的影響Fig 2 Effectsof IL-23 on MMP-9 and MMP-2 expression activitiesof B16 cells

圖3 IL-23處理組腫瘤細胞磷酸化P65蛋白的表達Fig 3 The expression of phosphorylated P65 in IL-23 treated B16 cells

3 討論

慢性炎癥在多種腫瘤的啟動、進展及轉移潛能中起著致病因子作用，炎癥性細胞因子的異常表達,可以在體內募集單核巨噬細胞、中性粒細胞等到達腫瘤臨近的部位，形成有利于腫瘤生長和侵襲的微環境，誘導腫瘤血管生成促進腫瘤發展進程。IL-23是近年來發現的一種同時參與慢性炎癥形成和腫瘤發生的細胞因子，研究表明IL-23可促進局部環境中炎癥介質的釋放，抑制機體特異性免疫監視，促進黑色素瘤的發生與生長[3]；IL-23可激活Stat3信號通路，在肺癌細胞的增殖過程中發揮重要作用，并呈現其濃度依賴性[4]；IL-23也可在肝癌的發展過程中激活NF-κB信號通路加速其轉移和侵襲[5]。因此針對IL-23與腫瘤細胞關系的研究對腫瘤的防治、免疫應答及調節都有重要意義。

Langowski[3]發現IL-23p19缺失的小鼠能夠抵抗腫瘤發生，同時阻斷IL-23信號通路也能抑制腫瘤生長。本文前期建立荷瘤小鼠-慢性炎癥復合模型[6]研究中，進一步證實了IL-23對腫瘤的生長具有調節作用。最近研究表明低濃度外源性IL-23可直接促進肺癌腫瘤細胞的增殖，并參與腫瘤微環境的形成；高濃度IL-23則抑制腫瘤細胞增殖[4]。而本實驗體外IL-23刺激B16細胞，腫瘤細胞增殖活性卻未見明顯提升，提示IL-23在不同腫瘤疾病中作用機制可能存在差異，不同IL-23濃度下腫瘤細胞的增殖效應也不盡相同。綜合前期體內模型結果[6]，實驗組血清檢測IL-23表達升高的同時，移植瘤微血管密度（MVD）等指標顯著增加，本文推測在黑色素瘤發生發展的過程中，IL-23可能通過誘導黑色素瘤細胞或基質細胞分泌MMPs、VEGF等介質，促進腫瘤血管生成進而促進腫瘤生長。

IL-23促進腫瘤微環境中Th0細胞分化為Th17細胞，Th17細胞產生IL-17A，IL-17A可以通過NF-κB上調基質金屬蛋白酶的表達來促進肝癌細胞的侵襲和遷移[7]，但IL-23對腫瘤的侵襲是否有直接的作用少見報道。本文侵襲實驗結果顯示，IL-23處理后B16細胞穿膜細胞數明顯增多，上述增殖實驗提示穿膜數的增加并非由增殖引起，說明IL-23促進了B16細胞的體外侵襲。MMPs是一類與腫瘤侵襲相關的鋅依賴性肽鏈內切酶家族，其相關的信號傳導通路參與了腫瘤細胞的生長、腫瘤侵襲及腫瘤血管的形成[8]，目前發現的MMPs有23種，MMP-2、MMP-9等與腫瘤的侵襲和遷移相關，本文明膠酶譜分析IL-23處理B16細胞的MMP-9活性明顯增強，說明IL-23可通過上調MMP-9的活性促進B16細胞的侵襲。Western blot分析顯示IL-23促進了磷酸化P65的表達，從而激活NF-κB信號通路，說明NF-κB是MMP-9表達的關鍵轉錄因子，印證了NF-κB通路是炎癥與腫瘤相聯系的關鍵點[9]，NF-κB信號通路的活化參與了惡性腫瘤發生發展的多個環節[10]。

綜上所述，IL-23對黑色素瘤B16細胞的增殖無明顯的刺激作用，可通過提高MMP-9的活性而增強細胞的體外侵襲能力，這一促進作用與腫瘤細胞NF-κB信號通路的上調有關。本文研究IL-23在慢性炎癥與腫瘤進展中的調節作用，并為以IL-23作為新的生物治療靶點應用于臨床提供了一定的實驗依據。

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