肝豆靈對銅負荷肝纖維化大鼠肝星狀細胞凋亡的影響

張 娟，謝道俊，韓 輝，沈 斌，鮑遠程，童建兵，周 磊，楊 波，丁偉軍

（1.安徽中醫藥大學第一附屬醫院神經內科，安徽合肥 230031；2.湖北中醫藥大學，湖北武漢 430065）

肝豆靈對銅負荷肝纖維化大鼠肝星狀細胞凋亡的影響

張 娟1，謝道俊1，韓 輝1，沈 斌2，鮑遠程1，童建兵1，周 磊1，楊 波1，丁偉軍1

（1.安徽中醫藥大學第一附屬醫院神經內科，安徽合肥 230031；2.湖北中醫藥大學，湖北武漢 430065）

目的 觀察肝豆靈對銅負荷肝纖維化大鼠肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSC）凋亡的影響，探討肝豆靈防治Wilson病肝纖維化的作用機制。方法 將75只大鼠分成空白組、模型組、肝豆靈組、青霉胺組及肝豆靈＋青霉胺組，采用喂食硫酸銅飲食復制銅負荷大鼠模型，采用TUNEL法檢測HSC的凋亡。結果 模型組可見大量HSC增生；與模型組比較，各治療組HSC數量顯著降低（P＜0.01），HSC凋亡指數顯著升高（P＜0.01）；肝豆靈＋青霉胺組AI顯著高于肝豆靈組和青霉胺組（P＜0.01）。討論 肝豆靈可促進銅負荷大鼠HSC的凋亡，其與青霉胺聯合用藥的作用更顯著。

肝豆狀核變性；肝纖維化；銅負荷；肝星狀細胞；肝豆靈；青霉胺

Wilson病（Wilson's disease，WD）作為銅代謝障礙性疾病，其發生肝臟病變的根本原因是肝細胞中ATP7B酶功能缺陷，不能將多余的銅離子從細胞內轉運出去，造成游離銅在肝組織內緩慢蓄積。肝臟是銅代謝的中心器官，過度沉積的銅損害肝細胞，引起肝細胞變性壞死、炎性改變及肝纖維化，臨床表現為活動性壞死后肝硬化或代償性肝硬變。研究證實肝星狀細胞（hepatic stellate cells，HSC）的激活是肝纖維化發生的主要環節，激活的HSC大量增殖，發生表型改變、分泌過多的細胞外基質（extra cellular matrix，ECM）沉積于肝臟是肝纖維化形成的關鍵［1］。WD肝纖維化引起的肝功能衰竭通常是WD患者死亡的主要原因。因此，重視對WD肝纖維化的早期干預，對于改善WD患者的肝功能及預后都具有十分重要的意義。本實驗采用肝豆靈治療WD大鼠肝纖維化，旨在研究此方對HSC凋亡的影響，以探討其治療WD肝纖維化的作用機制。

1 材料

1.1 動物 實驗用清潔級Wistar大鼠75只，雌雄各半，月齡均為3個月，平均體質量（200±20）g，購于南京醫科大學實驗動物中心，實驗動物生產許可證號：SCXK（蘇）2008－0004。動物房為普通級飼養室，實驗前先適應性飼養1周。

1.2 主要儀器 切片機（Leica RM2135）：德國；切片漂烘儀（科力飛QP－B）：安徽合肥電子研究所；石蠟包埋機（亞光YB－7B）：湖北孝感；圖像采集及圖像分析系統：美國Bio－Rad生物儀器設備公司。

1.3 試劑和藥物 二氨基聯苯胺（diaminobenzidine，DAB）：北京中山生物技術公司；末端脫氧核苷酸轉移酶介導的dUTP缺口末端標記（terminal dexynucleotidyl transferase（TdT）－mediated dUTP nick end labeling，TUNEL）試劑盒：美國Roche公司；硫酸銅：天津巴斯夫化工公司；肝豆靈成藥（院藥制字Z20050071）：每片0.3g，安徽中醫藥大學第一附屬醫院制劑室提供；陽性藥物青霉胺（國藥準字H31022286）：每片0.125g，上海信誼藥廠有限公司生產。

2 方法

2.1 模型復制和分組 75只大鼠隨機分為5組，每組15只，分別為空白對照組、模型對照組、肝豆靈組、肝豆靈加青霉胺組、青霉胺組。從實驗第1天開始，除空白對照組予以普通飼料，其余4組均參照文獻［2］復制銅負荷大鼠模型，即給予含硫酸銅1g／kg的飼料和0.185％硫酸銅的水，飼養12周。各組大鼠每天每只進食相等，并自由飲水。從第7周第1天開始各治療組大鼠均予以相應藥物灌胃。肝豆靈組大鼠按受肝豆靈0.486g／kg（相當于成人臨床用量的6.3倍）灌胃，肝豆靈加青霉胺組大鼠接受肝豆靈0.486g／kg和青霉胺0.09g／kg（相當于成人臨床用量的6.3倍）灌胃，青霉胺組大鼠僅接受青霉胺0.09g／kg灌胃，空白組和模型組大鼠接受等容量生理鹽水灌胃。均每日1次，共6周。在第13周實驗結束后，共死亡大鼠26只，剩余49只，各組動物禁食12h，在2％戊巴比妥鈉腹腔麻醉下，分別留取血清、肝組織標本。

2.2 指標檢測 采用TUNEL法檢測細胞凋亡。結果判定：胞質棕黃色的細胞為HSC，凋亡的HSC為胞質、胞核均呈棕黃色的梭型細胞。隨機取5個

不同高倍視野觀察，計數胞質為棕黃色的HSC的數量和胞質、胞核均呈棕黃色的梭型凋亡細胞的數量，并計算凋亡細胞百分比，取5個視野的平均數，得到凋亡指數（apoptosis index，AI）。AI＝凋亡細胞數／HSC數。

2.3 統計學方法 采用SPSS 19.0進行統計學分析。連續型變量用“均數±標準差（±s）”進行統計學描述。采用Kruskal－Wallis檢驗比較多組間HSC中位數，采用Mann－Whitney檢驗比較兩組間HSC中位數；采用單因素方差分析比較5組間AI均數，采用Dunnett's T3檢驗比較兩組間AI均數。P＜0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

空白組未見HSC表達，模型組可見大量HSC表達，各治療組可見棕黃色、梭形、凋亡的HSC，增生的HSC數量較模型組明顯減少。見圖1。

與空白組比較，模型組HSC數量及AI顯著升高（P＜0.01）；與模型組比較，各治療組HSC數量顯著降低（P＜0.01），AI顯著增高（P＜0.01）；其中肝豆靈＋青霉胺組AI顯著高于肝豆靈組和青霉胺組（P＜0.01）。見表1。

注：紅色箭頭示凋亡的HSC。圖1 各組HSC細胞凋亡情況比較

4 討論

肝臟是動物體內儲存銅的重要器官，同時也是進行銅代謝的重要場所，WD患者自出生后銅就開始不斷地在肝臟內蓄積，所以即使是青少年WD患者，其肝臟銅的積蓄量也往往超過正常人的10倍以上［3］。研究認為在WD的早期（無癥狀期），肝臟內已經出現線粒體明顯形態異常。動物實驗證實銅過載能誘發多種動物肝損害，當蓄積超過各種細胞器含銅蛋白質負載能力時，就會對細胞產生毒性，引起脂質過氧化、谷胱甘肽耗竭、線粒體損傷、溶酶體破裂，引起肝硬化。

表1 各組HSC數、AI比較（±s）

表1 各組HSC數、AI比較（±s）

注：a.中位數（四分位距）為101.50（29.72）；與空白組比較，＊＊P＜0.01；與模型組比較，＃＃P＜0.01；與肝豆靈＋青霉胺組比較，△△P＜0.01。

組 別n HSC細胞數AI空 白8 4.37±1.85 0.03±0.02模 型10 96.00±22.95＊＊a0.21±0.10＊＊肝豆靈＋青霉胺11 76.18±16.31＃＃0.56±0.04＃＃肝豆靈10 57.80±10.76＃＃△△0.41±0.06＃＃△△青霉胺10 63.00±15.60＃＃0.43±0.05＃＃△△

蓄積的銅本身毒性很強，并且可作為氧化物前體促進自由基和有害的脂質及蛋白氧化物形成。銅通過氧自由基活化HSC，導致肝損傷修復時ECM的合成與降解不平衡，特別是后期ECM降解減少是導致WD發生肝纖維化或肝硬化的主要機制。HSC的激活和增殖是肝纖維化形成的中心環節，因而采用不同途徑減少HSC的增殖并加速HSC的凋亡成為肝纖維化治療的切入點。

中醫學無肝纖維化病名，依據其肝硬化、腹水等表現，可屬于“癥瘕”“瘀血”“積聚”“臌脹”等范疇。中醫學認為先天不足、肝脾腎虧虛是引起本病的根本原因，情志失調、飲食不節、勞倦內傷等可誘發和加重本病。銅毒入里，臟腑功能失調致運化失常，蓄積體內，經過量變到質變，復感毒邪，外受內化而使銅毒加重。發病以青少年多見，多起病緩慢，逐漸加重。早期以氣血虧虛、肝脾腎不足為主，臨床期多以濕熱蘊結、痰瘀阻絡為主要表現。本病為本虛標實證，早期多虛，中后期多實，虛實夾雜。毒邪為害，銅毒、濕熱、痰濁、瘀血為標，而變生諸癥。現代醫學已證實WD患者的銅中毒，主要是內在遺傳缺陷，即先天稟賦不足，致機體陰陽失和，臟腑功能失調和氣血運行不暢，導致膽汁不泌，銅毒不泄，蘊積體內而化生銅毒。WD肝纖維化因銅濁毒邪蓄積于肝，致肝之疏泄失常，膽汁排泄不暢，濕熱銅毒內聚，外溢肌膚而為病，痰濁阻礙氣機，血行不暢，痰濁與瘀血相結，則成“積聚”，毒邪日久不去，留著體內，則可損傷絡脈。故WD肝纖維化的主要病機為銅毒內蘊、痰瘀阻絡。

通腑利濕、化瘀散結的中藥專方肝豆靈是針對以上病機研制的，該方由大黃、丹參、金錢草、黃連、姜黃、莪術等藥物組成。肝豆靈注重標本同治，不僅以通腑利濕之法促進銅毒的排出，同時佐以化瘀散

結法以治“積聚”“癥瘕”。前期研究［4］發現肝豆靈可干預銅負荷大鼠肝纖維化的作用。

研究表明，大黃素通過多種途徑發揮抗肝纖維化作用。體外實驗顯示大黃素可通過抑制蛋白酪氨酸激酶活性而發揮抑制HSC增殖的作用［5］。大黃素能濃度依賴地抑制細胞內膠原合成，降低膠原mRNA表達，促使ECM降解［6］。黃連具有抗氧化的作用，同時抑制膠原生成，促進病理沉積膠原的降解。黃連通過以上途徑而發揮抑制HSC增殖和誘導HSC凋亡的作用。李欣等［7］研究發現，丹參素能明顯抑制HSC的增殖活性和膠原表達，改善實驗動物肝臟纖維化程度。賴文芳等［8］研究結果提示，丹參具有改善肝臟血液循環，抑制膠原生成，促進膠原降解，干預細胞內信號傳導，抑制HSC活化的作用。丹參酸B能夠通過抑制細胞外信號調節激酶磷酸化，抑制HSC的增殖及活化。鄭元義等［9］研究結果提示，丹參素通過明顯抑制HSC增殖而防治大鼠免疫性肝纖維化，抑制轉化生長因子β、過氧化氫等誘導的HSC增殖，促其調亡。欒希英等［10］研究結果提示，三棱、莪術可降低肝纖維化大鼠白介素－1、白介素－6、腫瘤壞死因子－α的產生，抑制HSC的激活。李娟等［11］研究結果提示，三棱、莪術聯用可調節細胞凋亡相關蛋白bax、bcl－2表達，而起到抗肝纖維化作用。何雅軍等［12］研究結果提示，姜黃素可降低活化的HSC數量，增加HSC凋亡。

本研究表明，具有通腑利濕、化瘀散結作用的肝豆靈可促進HSC的凋亡，且以肝豆靈和青霉胺聯合用藥的效果為優，這可能是肝豆靈防治WD肝纖維化的作用機制之一。

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Effect of Gandouling on Apoptosis of Hepatic Stellate Cells in Copper－Overloaded Rats with Hepatic Fibrosis

ZHANG Juan1，XIE Dao－jun1，HAN Hui1，SHEN Bin2，BAO Yuan－cheng1，TONG Jian－bing1，ZHOU Lei1，YANG Bo1，DING Wei－jun1
（1.Department of Neurology，The First Affiliated Hospital of Anhui University of Chinese Medicine，Anhui Hefei 230031，China；2.Hubei University of Chinese Medicine，Hubei Wuhan 430065，China）

Objective To observe the effect of Gandouling on the apoptosis of hepatic stellate cells（HSCs）in copper－overloaded rats with hepatic fibrosis and to investigate the action mechanism of Gandouling in the prevention and treatment of hepatic fibrosis in Wilson's disease.Methods Seventy－five rats were divided into blank group，model group，Gandouling group，penicillamine group，and Gandouling plus penicillamine group.All rats except those in blank group were given copper sulfate－containing feed to induce a copper－overloaded

Wilson's disease；hepatic fibrosis；copper overload；hepatic stellate cell；Gandouling；penicillamine

R575.2＋4

A

10.3969／j.issn.2095－7246.2014.02.023

2013－07－07）

國家自然科學基金項目（81202692）；安徽高校省級自然科學研究項目（KJ2012Z223）

張娟（1975－），女，博士，主治醫師

rat model.The apoptosis of HSCs was detected by terminal deoxynucleotidyl transferase－mediated dUTP nick end labeling.Results The model group had extensive proliferation of HSCs.Compared with the model group，all treatment groups had significantly reduced numbers of HSCs（P＜0.01）and significantly increased apoptotic indices（AIs）（P＜0.01）；the Gandouling plus penicillamine group had a significantly higher AI than the Gandouling group and penicillamine group（P＜0.01）.Conclusion Gandouling can promote the apoptosis of HSCs in copper－overloaded rats，and it has better efficacy when used in combination with penicillamine.