參歸益智方對阿爾茨海默病大鼠海馬組織VEGF、p－p38MAPK表達的影響

張會凱，劉亞敏，冀 緒，張 江，李瑞杰

（1.河北省新樂市中醫醫院中風病二科，河北石家莊 050700；2.武警后勤學院附屬醫院病理科，天津 300162）

參歸益智方對阿爾茨海默病大鼠海馬組織VEGF、p－p38MAPK表達的影響

張會凱1，劉亞敏2，冀 緒1，張 江1，李瑞杰1

（1.河北省新樂市中醫醫院中風病二科，河北石家莊 050700；2.武警后勤學院附屬醫院病理科，天津 300162）

目的 觀察參歸益智方對阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）大鼠行為學障礙的改善作用并探究其作用機制。方法 將40只SD大鼠隨機分為空白組，模型組，參歸益智方低、高劑量組，每組10只。采用β淀粉樣蛋白1－42雙側注射大鼠海馬區誘導AD模型，通過Morris水迷宮檢測AD大鼠行為學改變，采用Western blotting檢測大鼠海馬組織血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38mitogen－activated protein kinase，p38MAPK）及磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶（phosphorylation of p38mitogen－activated protein kinase，p－p38MAPK）的表達水平。結果 給藥4周末，參歸益智方能夠劑量依賴地降低AD大鼠Morris水迷宮試驗的逃避潛伏期（P＜0.05），顯著提高穿越平臺次數（P＜0.05），劑量依賴地提高AD大鼠海馬VEGF表達水平，顯著降低AD大鼠海馬p－p38MAPK表達水平。結論 參歸益智方改善AD大鼠行為學障礙的作用與其提高海馬區VEGF表達，降低p－p38MAPK表達有關。

參歸益智方；阿爾茨海默病；血管內皮生長因子；絲裂原活化蛋白激酶；β淀粉樣蛋白

阿爾茨海默病（Alzheimer's disease，AD）是臨床上老年人常見的神經系統退行性疾病，以進行性認知功能障礙、記憶力減退及行為異常等為主要特征，嚴重威脅著老年人的健康。早在25年前就有國外研究者認為血管內皮功能障礙參與了AD的發生和發展［1］。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是血管內皮細胞分泌的特異性有絲分裂原，可以促進動脈、靜脈以及淋巴管來源的內皮細胞的生長［2］。因此，對AD患者血管危險因素進行干預可能是AD預防及治療的一條新途徑。本研究通過觀察參歸益智方對AD模型大鼠行為學改變及海馬組織VEGF、p38絲裂原活化蛋白激酶（p38mitogen－activated protein kinase，p38 MAPK）蛋白表達的影響，探討其對AD的治療作用及機制。

1 材料

1.1 實驗動物 采用SPF級雄性SD大鼠，由河北醫科大學動物實驗中心提供（合格證號915013），體質量為（250±50）g，月齡4個月。

1.2 主要藥物和試劑 參歸益智方：每劑含生藥232g，加水浸泡30min，文火煎煮2次，煎液合并，過80目篩過濾，95℃水浴濃縮成2.5g／ml的混懸液，高壓滅菌，4℃冰箱密閉保存備用，用前搖勻。β淀粉樣蛋白1－42（amyloidβ－protein 1－42，Aβ1－42）及β－actin單克隆抗體：美國Sigma公司，批號AAP519Q；VEGF、p38MAPK及磷酸化p38絲裂原活化蛋白激酶（phosphorylation of p38mitogenactivated protein kinase，p－p38MAPK）單克隆抗體：美國Cell Signaling公司，批號分別為E12501、126470、125503。

1.3 主要儀器 XR－XM101型Morris水迷宮：中國醫學科學院藥物研究所；NARISHIGESN－3型立體

定位儀：日本生產；Gel Doc XR型Gel Doc凝膠成像系統：北京德潤科儀科技發展有限公司。

2 方法

2.1 動物模型復制及分組［3］將大鼠按隨機數字表法隨機分為空白組，模型組，參歸益智方低、高劑量組，每組10只。除空白組外，其余各組大鼠進行模型復制。Aβ1－42用0.9％無菌生理鹽水稀釋成1μg／μl的溶液，37℃恒溫箱中孵育1周老化，10％水合氯醛（4ml／kg）腹腔注射麻醉后，參照包新民《大鼠腦立體定位圖譜》［3］定位，采用大鼠腦立體定位儀定位，前囟后3mm，正中矢狀縫左右旁開2mm，硬腦膜下3.5mm，即大鼠大腦海馬區，雙側注射Aβ1－42各5μl，每側注射時間不少于5min，留針5min，緩慢撤針，以防藥物通過針孔溢出，石蠟封口，無菌縫合。

2.2 給藥方法 將參歸益智方按文獻［4］折算成大鼠的等效劑量，高劑量按25g／kg、低劑量按12.5 g／kg灌胃給藥；空白組和模型組僅給予等容積生理鹽水。模型復制2周后，對4組大鼠均分別灌胃給予相應藥物或生理鹽水，每日2次，共4周。

2.3 觀察指標

2.3.1 行為學檢測：Morris水迷宮［5］是一個直徑為200cm、深60cm的圓形水箱，平均分成4個象限，水面下2cm處有1個直徑為9cm的平臺，位于其中1個象限的中心，實驗分為定位航行和空間探索實驗。模型復制1周后及藥物干預4周后分別進行水迷宮實驗，前5d進行定位航行實驗，所有大鼠實驗前均不進行水迷宮訓練，以排除人為干擾等因素。將大鼠面向池壁分4個象限放入水中，記錄大鼠從入水至爬上平臺的時間，即逃避潛伏期。如果在120s內未能發現平臺，將其引至平臺停留10s，這個象限記為120s，上午和下午各進行1次，每日2次，4個象限的平均值記為大鼠當日的結果。第6天撤除平臺，將大鼠任選1個入水點放入水中，記錄60s內游過原平臺的次數，上午和下午各進行1次，取2次的平均值作為該只大鼠游過平臺的次數。

2.3.2 p－p38MAPK的表達：實驗結束后，采用10％水合氯醛腹腔注射將各組大鼠麻醉，斷頭，低溫分離海馬組織，超聲勻漿器破碎海馬組織，低溫（4℃）10 000r／min離心10min，取上清，即為海馬的蛋白提取物。采用二辛可酸（bicinchoninic acid，BCA）法測定蛋白濃度；以β－actin作為內參照，采用Western Blotting法測定VEGF、p38MAPK、p－p38 MAPK的表達水平。清洗玻璃板、烤干、灌膠，取60 μg目的蛋白，100℃加熱10min，經10％SDSPAGE凝膠電泳，轉印至聚偏二氟乙烯（polyvinylidene fluoride，PVDF）膜上，5％脫脂牛奶封閉1h后，加入VEGF、p38MAPK、p－p38MAPK抗體（1∶500），4℃水平搖床過夜。第2天TPBS液洗滌4次，每次5min，加入二抗羊抗兔稀釋液（1∶1 000）室溫下避光搖床上孵育2h，常規洗膜后采用Gel Doc凝膠成像系統掃膜、分析，得出β－actin、VEGF、p38MAPK和p－p38MAPK的灰度值，分別以VEGF、p38MAPK與相應β－actin灰度值比值表示VEGF、p38MAPK蛋白的表達水平；p－p38MAPK與p38MAPK灰度值比值表示p－p38蛋白的表達水平。

2.4 統計學方法 采用SPSS 13.0進行統計學分析，連續型變量采用“均數±標準差（±s）”進行統計學描述。多組間均數比較采用單因素方差分析，兩組間均數比較采用SNK－q檢驗（方差齊）或Dunnett's T3（方差不齊）進行檢驗。以P＜0.05為差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 行為學檢測結果 模型復制1周末，模型組，參歸益智方高劑量組和低劑量組較空白組逃避潛伏期顯著延長（P＜0.05），穿越平臺次數顯著減少（P＜0.05）。給藥4周末，參歸益智方高劑量組和低劑量組較模型組逃避潛伏期顯著縮短（P＜0.05），穿越平臺次數顯著增多（P＜0.05）；參歸益智方高劑量組較低劑量組逃避潛伏期顯著縮短（P＜0.05），穿越平臺次數顯著增多（P＜0.05）。見表1。

表1 各組大鼠Morris水迷宮試驗結果比較（±s）

表1 各組大鼠Morris水迷宮試驗結果比較（±s）

注：與空白組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05；與參歸益智方低劑量組比較，△P＜0.05。

組 別n逃避潛伏期／s周末空 白10 44.08±2.88 46.42±4.92 6.05±1.34 6.05±1.14模型復制1周末給藥4周末穿越平臺次數模型復制1周末給藥4模 型10 78.56±4.55＊77.29±6.69 3.95±1.07＊3.65±0.62參歸益智方（低）10 75.56±5.49＊63.64±4.35＃4.05±0.98＊4.45±0.86＃參歸益智方（高）10 77.48±6.97＊53.98±4.46＃△4.15±0.91＊5.25±0.52＃△

3.2 大鼠海馬組織VEGF、p38MAPK、p－p38MAPK蛋白表達水平比較 與空白組比較，模型組VEGF表達水平顯著降低（P＜0.05），p－p38MAPK表達水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，參歸益智方高劑量組和低劑量組VEGF表達水平顯著升高（P＜0.05），p－p38MAPK表達水平顯著降低（P＜0.05）；參歸益智方高劑量組與低劑量組VEGF、p－p38MAPK表達水平比較，差異具有統計學意義（P＜0.05）。4組p38MAPK表達水平比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見圖1、表2。

圖1 各組大鼠海馬VEGF、p38MAPK及p－p38MAPK表達水平比較（Western blotting法）

表2 各組大鼠海馬中VEGF、p38MAPK、p－p38MAPK表達水平比較（±s）

表2 各組大鼠海馬中VEGF、p38MAPK、p－p38MAPK表達水平比較（±s）

注：與空白組比較，＊P＜0.05；與模型組比較，＃P＜0.05；與參歸益智方低劑量組比較，△P＜0.05。

組 別n VEGF p38MAPK p－p38MAPK空 白10 0.79±0.04 0.72±0.13 0.18±0.04模 型10 0.33±0.03＊0.73±0.11 0.55±0.06＊參歸益智方（低）10 0.45±0.04＃0.76±0.14 0.38±0.05＃參歸益智方（高）10 0.62±0.10＃△0.81±0.12 0.24±0.04＃△

4 討論

明代張景岳第一次提出了“癡呆”，“癡呆者，凡平素無痰，而或以郁結，或以不遂，或以思慮，或以疑惑，或以驚恐而漸癡呆，言辭顛倒，舉動不經……其證則千奇萬怪，無所不知。”（《景岳全書·雜癥謨》）歷代很多醫家認為腎虧、腎精不足是老年癡呆的發病根本。腎乃先天之本，藏精主骨生髓通于腦，腎所藏之精氣為人體生命之本，在人的生長壯老已的過程中起著主導作用，多數醫家從腎精不足來進行治療，以補腎填精、健腦益智來延緩衰老和治療老年癡呆［6］。參歸益智方由人參、當歸、何首烏、黃芪、丹參、川芎、赤芍、水蛭、熟地黃、菟絲子、半夏、茯苓、炙甘草組成，其中人參甘微苦溫，入心脾肺經，大補元氣、安神益智，有“百草藥王”的美稱；當歸甘補辛行，溫通質潤，甘溫微澀，專能補血，入心肝脾經，為“血家之圣藥”；何首烏入肝腎二經，甘溫微澀，補益精血，收斂精氣，為須發早白、早衰要藥。三藥配伍，共為君藥，奏補益氣血、填精益髓、健腦益智之功。黃芪補氣，丹參活血調經、清心安神，川芎活血行氣，為“血中氣藥”，赤芍涼血活血，水蛭破血消癥，共為臣藥，益氣活血。佐以熟地黃滋補肝腎、填精益髓，菟絲子平補肝脾腎，茯苓健脾安神，半夏燥濕化痰，甘草調和藥性。諸藥合用具有補腎健腦、益氣活血、化痰開竅的功效。

近年來研究發現，Aβ是老年斑的主要成分，對AD的病理和發展起決定性作用，Aβ持續激活炎性修復機制，將正常情況下的急性反應轉變為慢性炎性損傷，激活大量炎性因子，導致神經細胞變性、壞死［7］。模型復制1周末，模型組、低劑量組和高劑量組比空白組逃避潛伏期明顯延長，穿越平臺次數明顯減少，出現了AD的行為學改變，提示側腦室注射Aβ1－42可成功復制AD模型。

目前，腦血管病已成為AD的危險因素之一。研究發現AD患者出現癡呆癥狀前就已經出現了腦血管病變，長期的腦供血不足使腦組織缺乏葡萄糖和氧氣，高爾基體受損，ATP合成減少，異常APP翻譯加工，生成大量的具有神經毒性的Aβ，促進和加速老年斑的形成［8］。p38MAPK通路能被各種細胞外刺激、炎性因子等啟動，被磷酸活化后移位入核，激活下游轉錄因子，調節基因轉錄，誘導Bax轉位，介導Caspase－3活化，上調腫瘤壞死因子－α的表達，促使細胞凋亡［9］。本研究中，VEGF在藥物干預組中表達明顯升高，并且隨著劑量增加，升高更為明顯，說明參歸益智方能夠提高VEGF的表達。血管內皮功能得到不同程度恢復，可促進腦部血液循環，加速對Aβ的吸收和分解，減少Aβ的沉積［10］。VEGF的持續表達能促進缺血區血管的生成，在體外培養細胞的實驗中，加入VEGF可以使去血清培養的腦神經細胞存活的數目增多［11］。AD轉基因小鼠連續3d腹腔注射VEGF，海馬組織Aβ沉積明顯減少，學習記憶能力得到明顯改善［12］。4組p38 MAPK表達無明顯差異，p－p38MAPK在模型組表達水平最高，在低劑量組表達水平顯著下降，在高劑量組表達水平較低劑量組顯著降低，表明Aβ的沉積可以誘導大腦海馬炎性反應，使炎性細胞因子及p－p38MAPK過度表達。p38MAPK信號通路的激活與AD病理過程中的炎性機制是密切相關的，參歸益智方能夠抑制p－p38MAPK信號分子的表達，減少炎性因子的釋放，抑制細胞凋亡。

本研究結果表明，參歸益智方能劑量依賴性地改善AD大鼠的行為學障礙，其機制與上調海馬

VEGF表達水平，抑制海馬p－p38MAPK表達水平具有一定相關性。

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Effects of Shengui Yizhi Prescription on Expression of Vascular Endothelial Growth Factor and Phosphorylated p38 Mitogen－Activated Protein Kinase in Hippocampus of Rats with Alzheimer's Disease

ZHANG Hui－kai1，LIU Ya－min2，JI Xu1，ZHANG Jiang1，LI Rui－jie1
（1.Second Department of Stroke，Xinle Hospital of Traditional Chinese Medicine，Hebei Shijiazhuang 050700，China；2.Department of Pathology，Affiliated Hospital of Armed Police Logistics College，Tianjin 300162，China）

Objective To observe the efficacy of Shengui Yizhi Prescription in the treatment of behavioral disturbance among rats with Alzheimer's disease（AD）and to investigate its action mechanism.Methods Forty Sprague－Dawley rats were randomly and equally divided into blank group，model group，and low－，and highdose Shengui Yizhi Prescription groups.Beta－amyloid（1－42）was injected into the bilateral hippocampus of rats to induce an AD model.The learning and memory ability was evaluated by Morris water maze（MWM）test.The expression of vascular endothelial growth factor（VEGF），p38mitogen－activated protein kinase（p38MAPK），and phosphorylated p38MAPK（p－p38MAPK）was measured by Western blotting.Results At the end of 4－week treatment，Shengui Yizhi Prescription reduced escape latency（P＜0.05）and significantly increased the number of platform crossings（P＜0.05）in a dose－dependent manner，as shown by the MWM test；in addition，it increased the expression of VEGF in the hippocampus and significantly reduced the expression of p－p38MAPK in the hippocampus in a dose－dependent manner.Conclusion Shengui Yizhi Prescription can reduce behavioral disturbance in AD rats，possibly by increasing VEGF expression and reducing p－p38MAPK in the hippocampus.

Shengui Yizhi Prescription；Alzheimer's disease；vascular endothelial growth factor；mitogenactivated protein kinase；beta－amyloid

R743

A

10.3969／j.issn.2095－7246.2014.02.024

2014－12－31）

張會凱（1977－），男，碩士，主治醫師