丹參川芎有效成分配伍對缺氧損傷大鼠腦內皮細胞的影響

管敏國，張宇燕，萬海同，周 鵬，楊 珍，楊潔紅

（1.浙江中醫藥大學基礎醫學院，浙江杭州 310053；2.浙江中醫藥大學心腦血管病研究所，浙江杭州 310053）

丹參川芎有效成分配伍對缺氧損傷大鼠腦內皮細胞的影響

管敏國1，張宇燕2，萬海同2，周 鵬2，楊 珍1，楊潔紅1

（1.浙江中醫藥大學基礎醫學院，浙江杭州 310053；2.浙江中醫藥大學心腦血管病研究所，浙江杭州 310053）

目的 研究丹參川芎有效成分不同配伍對缺氧損傷大鼠腦微血管內皮細胞（rat brain microvascular endothelial cells，rBMECs）的影響，并找出較優組合。方法 采用體外培養的rBMECs，并進行兔抗鼠Ⅷ因子鑒定，建立體外細胞缺氧模型。對參芎有效成分丹參素（A）、丹參酮Ⅱa（B）、川芎嗪（C）、藁本內酯（D）、阿魏酸（E），以3個劑量水平進行正交實驗，另設正常組、模型組，觀察不同配伍對細胞中超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）活性、細胞上清液乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）、細胞凋亡率及細胞周期的影響。采用正交方差分析、直觀綜合分析對實驗結果進行多指標優化。結果 與模型組比較，各配伍樣品均可提高SOD活性，降低LDH含量，減少細胞早期凋亡，抑制缺氧誘導的rBMECs發生G1／S期阻滯的作用。正交方差分析表明：A2B1C3D2E1為SOD的較優組合，A3B1C1D2E3為LDH的較優組合，A2B1C2D3E2為早期凋亡的較優組合，A2B3C3D3E2為G1期的較優組合，A2B3C3D2E2為S期的較優組合；綜合分析結果顯示A2B1C1D3E2為多指標的較優組合。結論 丹參川芎有效成分不同配伍可在一定程度上保護缺氧對rBMEC的損傷，不同配伍作用方式的側重不同。

缺血性腦血管病；丹參；川芎；正交試驗

缺血性腦血管病是指腦血管一時供血不足導致該供血區局灶性腦功能障礙，有較高的致殘率和病死率，改善缺血半暗帶區的血液供應是治療關鍵。血管內皮細胞具有維持管壁通透性、抗凝、抗血栓形成、纖維溶解等廣泛生理功能，它作為組織與血液間的第一道屏障，是最先感受缺氧的細胞之一［1］，血管內皮細胞損傷是腦缺血損害的早期病變和基本動因［2］，因此有效保護血管內皮細胞是預防和治療心腦血管疾病的關鍵。

丹參、川芎屬于活血化瘀藥物，在臨床治療心腦血管疾病中往往配伍使用。以往對丹參、川芎的化學成分和藥理活性已進行了較多的基礎研究，發現其具有廣泛的心腦血管方面活性［3－4］，但大都局限于單一成分研究。而中藥成分復雜，其特點是多靶點、多渠道、多成分，往往不是一個有效成分，而是有效成分之間的相互協同、相加甚至拮抗的共同效應發揮療效，因此中藥應作為一個整體進行研究［5］。丹參主要有效部位為丹參水溶性和丹參脂溶性；川芎主要有效部位為川芎生物堿、川芎揮發油和川芎酚酸性。本實驗從這5個主要有效部位中分別選取丹參素、丹參酮Ⅱa、川芎嗪、藁本內酯、阿魏酸5個有效成分，將這5個有效成分按正交試驗方法組成配比不同的18個組合物，研究其不同配伍對缺氧損傷大鼠腦內皮細胞的影響，并進行多指標評價，選出較優配伍組合。

1 材料

1.1 動物 SD乳鼠10只，雌雄各半，1～3日齡，由浙江中醫藥大學動物實驗中心提供，生產許可證號SCXK（滬）2008－0016，上海西普爾－必凱實驗動物有限公司提供。

1.2 藥品與試劑 丹參素鈉：上海源葉生物科技有限公司，批號20120311；丹參酮Ⅱa、鹽酸川芎嗪、阿魏酸：中國藥品生物制品檢定所，批號分別為110766－200619、110817－201006、110773－200611；藁本內酯：天津馬克生物技術有限公司，批號20130420。丹參酮Ⅱa、藁本內酯分別用終濃度為0.04％、0.0025％的二甲基亞砜溶解（當二甲基亞砜≤0.1％時，不引起細胞生物學性狀改變），4℃冷藏備用。M199培養基：Gibco公司；胎牛血清：杭州四季青公司；胰蛋白酶、Ⅱ型膠原酶、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、D－Hank液、異硫氰酸熒光素（fluorescein isothiocyanate，FITC）標記山羊抗兔IgG、碘化丙啶（propidium iodide，PI）、兔抗鼠Ⅷ因子相關抗原抗體、雙金雞納酸（bicinchoninic acid，BCA）試劑：均購自北京鼎國昌盛生物技術有限責任公司；FITC膜聯蛋白Ⅴ（An－

nexinⅤ，AV）細胞凋亡檢測試劑盒、PI／RNase staining緩沖液試劑盒：購自BD公司；超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）、乳酸脫氫酶（lactate dehydrogenase，LDH）：購自南京建成生物工程研究所；其余試劑均為市售分析純。

1.3 儀器設備 3111型CO2培養箱：Thermo Scientific公司；SW－CJ－2D超凈工作臺：蘇州凈化設備有限公司；LDZ5－2型低速自動平衡離心機：北京京立離心機有限公司；DMI4000B熒光倒置顯微鏡：德國徠卡公司；BD FACSCulibur流式細胞儀和Thermo Scientific Varioskan Flash酶標儀：美國BD公司；自制缺氧罐；Eppendorf移液槍。

2 方法

2.1 大鼠腦微血管內皮細胞（rat brain microvascular endothelial cells，rBMECs）的培養 參考吳秀芹等［6］培養rBMECs的方法并加以改進。取10只1～3日齡SD乳鼠，頸椎脫臼處死，浸入75％乙醇中1～3min后，沿背正中線剪開頭部皮膚，沿中線剪開顱骨并剝離，無菌取出大腦半球，立即放入含冷D－Hank液的培養皿里，用彎鑷小心去除腦干、小腦、海馬及大腦髓質并仔細剝離大腦皮質上軟腦膜和大血管，用D－Hank液清洗2次后，將大腦皮質移入無菌的培養皿里，使用眼科剪將大腦皮質剪碎成1mm3大小的組織碎塊，以上操作均在冰袋上進行。將剪碎的組織用0.25％胰蛋白酶（含乙二胺二乙酸鈉）在37℃下消化20min，中途輕輕搖晃一次或不搖晃，加入含血清的培養基終止消化，輕輕吹打均勻，依次通過80、200目不銹鋼篩網濾過，收集200目上微血管段，離心（1 000r／min，10min），棄上清，在沉淀組織中加入適量0.1％Ⅱ型膠原酶，吹打均勻，37℃消化25min，10min搖晃1次，離心（1 000r／min，10min）。將下層沉淀用M199培養基漂洗1次，再次離心，沉淀用M199完全培養基懸浮，接種到細胞培養瓶中，37℃、5％CO2培養箱靜置培養12h后第一次換液，以后每隔2d換液1次，7～9d細胞生長成致密單層，出現“鋪路石”征象后進行傳代培養，取2～3代細胞用于實驗。用M199完全培養基將傳至第3代的rBMECs接種至6孔板上，置37℃、5％CO2培養箱中培養，2d換液1次，待細胞基本融合鋪滿后用于實驗。

2.2 rBMECs的鑒定 將細胞用37℃預熱的PBS漂洗，加入95％乙醇固定5min，PBS洗3遍，吸干，加稀釋10倍的兔抗鼠第Ⅷ因子抗體（陰性對照不加）和50μg／ml PI，以蓋住細胞為宜，37℃反應30 min，用PBS洗去未結合的抗體，加羊抗兔IgG－FITC，37℃反應30min，用PBS洗去未結合的抗體，甘油封片，于倒置顯微鏡下觀察。

2.3 正交實驗設計 經甲基噻唑基四唑拒染試驗確定各個藥物的毒性劑量范圍。將丹參素鈉、丹參酮Ⅱa、鹽酸川芎嗪、藁本內酯、阿魏酸的用藥濃度和配伍比例按L18（37）正交實驗進行分組，共分為18組，簡稱給藥正交組。見表1、表2。

表1 L18（37）正交設計因素水平表

表2 參芎有效成分L18（37）正交設計因素水平表

2.4 分組、給藥與模型復制 將基本融合鋪滿后的rBMECs分為正常組、模型組和給藥正交組，每組3個復孔。實驗前各孔吸去培養基，PBS洗1遍，正常組加入M199完全培養基1ml，模型組加入無血清M199培養基1ml，給藥正交組加入含相應藥物的無血清M199培養基1ml。正常組于37℃、5％ CO2培養箱中培養3h，其他各組放入密閉缺氧罐中，持續通入95％N2＋5％CO2的混合氣體，5min后用封口膜密封缺氧罐接口，置于37℃恒溫箱中繼續培養3h。倒置顯微鏡下觀察各組細胞形態。

2.5 檢測指標

2.5.1 SOD活性和LDH含量檢測：吸去各孔培養基，PBS洗2次，加入0.25％胰蛋白酶消化細胞，終止消化后離心收集細胞，在沉淀中加入1ml PBS，吹打均勻，再離心收集細胞沉淀，加入200μl PBS，吹打均勻，用超聲將細胞裂解，按試劑盒說明書方法測定SOD活性。收集各孔細胞上清液20μl，按試劑盒說明書操作，測440nm處吸光度（absorbance，A）值，計算LDH含量。

2.5.2 流式細胞儀檢測rBMECs早期凋亡及細胞

采用SPSS 21.0統計學軟件對數據進行處理，計量資料以“±s”表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD和Dunnet檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

周期：收集好細胞沉淀后，加AV結合緩沖液0.5 ml，吹打成細胞懸液，FITC AV／PI雙染后，黑暗中反應30min，流式細胞儀檢測凋亡。

收集好細胞沉淀后，以70％乙醇，－20℃固定一夜，PBS和Stain緩沖液分別清洗細胞1次，PI染色30min，上流式細胞儀檢測細胞周期。

2.6 統計學方法 采用SPSS 17.0進行統計學分析。呈正態分布的連續型變量采用“均數±標準差（±s）”進行統計學描述，多組間均數比較采用方差分析，兩組間均數比較采用LSD檢驗。正交試驗數據采用一般線性模型的Univariate程序進行正交方差分析。

3 結果

3.1 rBMECs鑒定 對用Ⅷ因子及二抗處理的細胞進行掃描，可見細胞核出現黃色熒光，胞質出現綠色熒光，細胞核與細胞質之間具有明顯的界限。而對照組只有細胞核顯示黃色熒光，胞質不出現綠色熒光，細胞核與細胞質之間也沒有明顯的界限。結果表明所培養的細胞存在Ⅷ因子相關抗原，可認為是內皮細胞。見圖1。

3.2 對缺氧損傷的rBMECs形態的影響 正常組rBMECs外觀呈梭形，形態飽滿，輪廓清晰，細胞核圓，核膜清晰，整體呈鋪路石狀。模型組大部分細胞由原本貼壁生長狀態變為收縮變圓狀態，且間隙變大，有出現凋亡及壞死細胞。給藥正交組對rBMECs缺氧損傷顯示出不同程度的保護作用。

圖1 第Ⅷ因子相關抗原免疫熒光鑒定（10×20倍）

3.3 對缺氧損傷的rBMECs中SOD、LDH的影響 與正常組相比，模型組SOD活性顯著降低，LDH釋放顯著增加（P＜0.05）。與模型組相比，1、2、3、4、6、8、9、13、14組SOD活性顯著升高（P＜0.05）；1、3、4、5、7、8、9、10、12、13、15、16、18組LDH釋放顯著降低（P＜0.05）。見表3。

3.4 對缺氧損傷的rBMECs早期凋亡的影響 與正常組比較，模型組rBMECs早期凋亡顯著增加（P＜0.05）。與模型組比較，1、2、4、5、6、7、9、10、11、13、14、17組細胞凋亡顯著減少（P＜0.05）。見表3。

3.5 對缺氧損傷的rBMECs細胞周期的影響 與正常組相比，模型組G1期rBMECs顯著增加（P＜0.05），S期和G2期rBMECs顯著減少（P＜0.05）。與模型組相比，2、3、4、5、6、8、9、10、14、15組G1期細胞顯著減少（P＜0.05）；2、3、4、5、6、8、9、14組S期細胞及2、3、4、5、8、9、14、15組G2期細胞顯著增加（P＜0.05）。見表3。

表3 參芎有效成分配伍對缺氧損傷的rBMECs中SOD活性、LDH含量、細胞凋亡率及細胞周期的影響（±s，n＝3）

表3 參芎有效成分配伍對缺氧損傷的rBMECs中SOD活性、LDH含量、細胞凋亡率及細胞周期的影響（±s，n＝3）

注：與正常組比較，△P＜0.05；與模型組比較，＊P＜0.05。

組別SOD／（U／mg）LDH／（U／L）凋亡率／％細胞周期／％ G1期S期G2期正常45.57±1.57 67.93±4.60 10.71±1.23 72.46±1.14 20.12±0.91 7.42±1.10模型33.09±1.01△168.47±3.15△41.58±2.45△89.11±0.91△8.32±0.22△2.57±0.82△1 39.87±1.51＊86.80±4.01＊30.33±0.86＊88.55±1.01 8.33±1.08 3.12±1.12 2 42.63±1.16＊166.87±2.50 23.62±1.76＊83.82±1.20＊10.46±1.19＊5.72±0.99＊3 39.29±2.19＊161.23±3.62＊42.60±2.41 75.61±0.93＊17.23±0.98＊7.16±0.34＊4 38.94±1.85＊111.26±4.07＊27.52±0.93＊75.19±0.84＊19.12±0.36＊5.69±0.76＊5 31.16±1.87 151.87±3.88＊29.44±1.44＊79.56±1.23＊14.46±1.19＊5.98±1.25＊6 38.21±1.13＊171.27±3.73 38.64±0.64＊80.49±0.94＊17.58±1.47＊1.93±1.30 7 32.59±1.35 92.58±2.95＊32.38±0.87＊87.80±1.03 8.48±0.79 3.72±0.89 8 40.45±1.34＊158.33±3.43＊42.78±2.70 77.17±0.96＊16.57±1.25＊6.26±0.98＊9 38.98±1.79＊87.34±3.16＊26.53±1.51＊77.52±1.02＊14.51±1.28＊7.97±1.40＊10 34.49±0.77 131.50±2.84＊23.90±1.18＊86.75±1.09＊9.08±0.27 4.17±1.03 11 35.29±1.31 169.27±2.64 38.64±0.64＊88.34±0.74 8.28±0.37 3.38±0.89 12 32.81±1.53 97.40±3.17＊41.98±1.53 89.43±1.33 8.17±0.35 2.40±1.29 13 44.87±1.81＊131.83±3.27＊27.63±0.86＊88.16±0.84 9.63±0.86 2.21±0.67 14 37.24±1.12＊171.07±3.65 33.61±1.99＊81.57±1.48＊11.89±0.51＊6.54±1.67＊15 34.65±1.24 101.00±2.91＊40.37±1.42 83.34±1.09＊10.30±0.32 6.36±1.39＊16 34.51±1.49 102.70±2.91＊41.46±1.50 88.81±1.07 8.81±1.17 2.38±1.35 17 33.03±1.25 168.00±2.39 37.54±1.68＊89.14±1.02 8.50±1.13 2.36±1.37 18 32.55±1.42 162.20±3.25＊40.39±1.49 89.64±1.15 8.30±0.99 2.06±0.31

3.6 正交實驗結果

3.6.1 正交方差分析：方差分析表明，因素E對SOD有顯著影響（P＜0.05），其強弱順序為E＞A＞D＞B＞C；因素B、C、D對LDH有顯著影響（P＜0.05），其強弱順序為B＞C＞D＞A＞E；因素A、B、C、D、E對早期凋亡都有顯著影響（P＜0.05），其強弱順序為E＞B＞D＞C＞A；因素A、C、D對G1期有顯著影響（P＜0.05），其強弱順序為C＞A＞D＞B＞E；因素A、C對S期有顯著影響（P＜0.05），其強弱順序為A＞C＞B＞D＞E。結果見表4。

表4 正交設計方差分析結果

3.6.2 正交直觀分析：由表5可知，在SOD指標中，A2B1C3D2E1為SOD的較優組合；依次類推，A3B1C1D2E3為LDH的較優組合；A2B1C2D3E2為早期凋亡的較優組合；A2B3C3D3E2為G1期的較優組合；A2B3C3D2E2為S期的較優組合。

3.6.3 多指標較優組合分析：綜合表4、表5分析，在較優組合中，因素A中水平2出現4次，水平3出現1次，出現水平3的在LDH指標中，而因素A對LDH無顯著影響，故在最優組合選擇中選A2；因素B中水平3對G1期、S期無顯著影響，故選B1；因素C中水平3對SOD無顯著影響，在早期凋亡中，水平1與水平2無顯著差異，在G1期、S期中，水平1與水平3均無顯著差異，故選C1；因素D中水平2對SOD、S期無顯著影響，因指標凋亡比指標LDH重要，故選D3；因素E中水平1對SOD無顯著影響，且因素E對LDH無顯著影響，故選E2；綜上所述，最終較優組合應為A2B1C1D3E2。

表5 正交設計直觀分析結果（±s，n＝3）

表5 正交設計直觀分析結果（±s，n＝3）

注：與水平1比較，△P＜0.05；與水平2比較，＃P＜0.05。

因素水平SOD／（U／mg）LDH／（U／L）凋亡率／％細胞周期／％ G1期S期A 1 37.40 135.57 33.51 85.42 10.26 2 37.51 139.72 32.87 81.39△13.83△3 35.35 128.52 36.85△＃85.01＃10.86＃B 1 37.55 109.44 30.54 85.88 10.57 2 36.63 164.18△34.27△83.27 11.69 3 36.08 130.18△＃82.67△12.68 C 1 36.79 120.67 33.49 83.68 11.51 2 36.10 133.79 32.58 86.40 9.92 3 37.36 149.35△＃38.42△＃81.73＃13.53＃D 1 35.96 142.19 35.67 86.07 10.48 2 37.33 123.04△36.29 82.96 12.24 3 36.97 138.57＃31.27△＃37.17△＃82.79△12.23 E 1 38.21 135.66 36.48 85.49 11.46 2 37.47 138.37 29.26△82.42△12.23 3 34.58△83.91 11.26＃129.77 37.48＃

4 討論

近年來，腦微血管內皮細胞（brain microvascular endothelial cells，BMECs）在各種心腦血管病中的作用日益受到重視，它是血腦屏障的重要組成部分，在維持血腦屏障的完整、中樞神經系統內環境的穩定和保持正常腦血流中發揮重要作用［7］。

缺氧能促使BMECs產生大量的活性氧，而自由基、活性氧、脂質過氧化物等均可引起BMECs損傷［8］。LDH是細胞損傷的重要標志之一，當細胞缺血缺氧時，細胞膜結構受到破壞，通透性增加，細胞內有氧代謝減少、無氧代謝增加，使胞內LDH產生增加，其漏出也相應增加。缺氧使細胞內Ca2＋濃度的升高，進而活化Ca2＋、Mg2＋依賴性核酸內切酶，使核染色質DNA降解成單個或寡核苷酸小體，誘導細胞凋亡［9］，而內皮細胞對抗細胞凋亡是維持血管完整和新生血管重建的關鍵［1］。

參芎有效成分配伍能提高SOD的活性，降低LDH的量，減少細胞早期凋亡，抑制缺氧誘導的rBMECs發生G1／S期阻滯從而發揮保護作用。筆者也發現并不是每一組配伍對這些指標的影響都是一致的，往往同一個組對這個指標有明顯保護作用，而對另一指標作用不明顯，這可能因為各個藥物作用的靶點不同，也可能因為藥物間存在拮抗作用，這就要求研究者要進行合理的配伍以使藥物的功效發揮最大化，這就得考慮每個藥物的劑量和各個藥物的配伍比例問題，要有中醫“君臣佐使”的思想。經過多指標的綜合分析，筆者找到一個較優配伍組合A2B1C1D3E2，即0.010mg／ml丹參素鈉、0.000 5 mg／ml丹參酮Ⅱa、0.015mg／ml鹽酸川芎嗪、0.010mg／ml藁本內酯、0.005mg／ml阿魏酸的配伍最優。該組合與第4組類似，只是藁本內酯由水平2變成了水平3，而第4組對每一個指標的作用

都是積極的，與模型組比較都有顯著差異（P＜0.05），這也間接反映這個較優組合的可靠性，但還應做進一步驗證。筆者認為在做這種組分配伍的實驗研究中，結合中醫的相關理論，也許會少走彎路，希望這種實驗思路和方法對中藥的標準化、客觀化及配伍規律提供有益借鑒。

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Effects of Different Doses of Active Ingredients in Salvia miltiorrhiza and Rhizoma Ligustici Chuanxiong on Rat Brain Microvascular Endothelial Cells during Hypoxic Injury

GUAN Min－guo1，ZHANG Yu－yan2，WAN Hai－tong2，ZHOU Peng2，YANG Zhen1，YANG Jie－hong2
（1.School of Basic Medical Sciences，Zhejiang Chinese Medical University，Zhejiang Hangzhou 310053，China；2.Institute of Cardio－Cerebrovascular Disease，Zhejiang Chinese Medical University，Zhejiang Hangzhou 310053，China）

Objective To investigate the effects of different doses of active ingredients in Salvia miltiorrhiza and Rhizoma Ligustici Chuanxiong on rat brain microvascular endothelial cells（rBMECs）during hypoxic injury and to determine the preferred dose combinations.Methods rBMECs were cultured in vitro and were identified with rabbit－anti－rat factorⅧantibody.The rBMECs were divided into normal group，model group，and test groups.An in vitro cell model of hypoxia was induced in the model group and test groups.The test groups were treated with different doses of tanshinol（A），tanshinoneⅡA（B），ligustrazine（C），ligustilide（D），and ferulic acid（E）.An orthogonal test was performed to investigate the effects of these active ingredients in Salvia miltiorrhiza and Rhizoma Ligustici Chuanxiong（each at three dose levels）on superoxide dismutase（SOD）activity in cells，lactate dehydrogenase（LDH）content in cell supernatant，cell apoptosis rate，and cell cycle.Orthogonal analysis of variance and direct comprehensive analysis were used to optimize the dose combination for these indices.Results Compared with the model group，the test groups had increased SOD activity，decreased LDH content，reduced early apoptosis，and inhibited G1／S arrest induced by hypoxia.The orthogonal analysis of variance showed that A2B1C3D2E1was the preferred dose combination for SOD，A3B1C1D2E3was the preferred dose combination for LDH，A2B1C2D3E2was the preferred dose combination for early apoptosis，A2B3C3D3E2was the preferred dose combination for G1phase，and A2B3C3D2E2was the preferred dose combination for S phase.The comprehensive analysis showed that A2B1C1D3E2was the preferred dose for multiple indices.Conclusion Different doses of active ingredients in Salvia miltiorrhiza and Rhizoma Ligustici Chuanxiong can reduce the hypoxic injury of rBMECs，and their action mechanism varies in different dose combinations.

ischemic cerebrovascular disease；Salvia miltiorrhiza；Rhizoma Ligustici Chuanxiong；orthogonal test

R285.5

A

10.3969／j.issn.2095－7246.2014.02.026

2013－12－19）

國家自然科學基金項目（81274176，81202636，81173647）；浙江省自然科學基金項目（LR12H27001）；浙江省中醫藥（中西醫結合）重點學科（2012－XK－A06）

管敏國（1985－），男，碩士研究生

楊潔紅，yjhong＠zxmu.edu.cn