HS-SPME-GC-MS分析不同產地香莢蘭豆揮發性成分

黎 強，盧金清*，郭勝男，蔡君龍，李肖爽

（湖北中醫藥大學 湖北省藥用植物研發中心，湖北 武漢 430065）

HS-SPME-GC-MS分析不同產地香莢蘭豆揮發性成分

黎 強，盧金清*，郭勝男，蔡君龍，李肖爽

（湖北中醫藥大學 湖北省藥用植物研發中心，湖北 武漢 430065）

目的：分析不同產地香莢蘭豆揮發性成分的組成。方法：采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質譜聯用技術，結合惠普-化學源化學工作站對不同產地的香莢蘭豆中揮發性化學成分進行定性分析，以峰面積歸一化法計算各組分的相對含量，并通過主成分分析和聚類分析2 種化學計量法對數據進行分析。結果：初步鑒定出104 種化合物，不同產地香莢蘭豆揮發性成分有一定差異。結論：此方法穩定可靠，適用于香莢蘭豆揮發性成分的快速分析，可為香莢蘭豆的質量評價提供一定的科學依據。

香莢蘭豆；揮發性成分；頂空固相微萃取；聚類分析；主成分分析

香莢蘭豆為蘭科香莢蘭屬植物香莢蘭（Vanilla planifolia Andr.）的成熟果實，具有息風止痙、鎮靜抗驚等功效[1]，其獨特的香味使其成為高級名酒、香煙、化妝品等的主要配香原料，具有“香料之王”的美譽[2]。香莢蘭豆浸膏等香莢蘭豆制品廣泛應用于飲料、冰琪淋、糖果、巧克力、培烤食品以及酒類和香煙中[3]。其主產于馬達加斯加、科摩羅、塔希提、墨西哥、印度尼西亞、留旺尼、烏干達、塞舌爾、毛里求斯等島嶼國或地區，全世界每年生產干燥完畢的香莢蘭豆莢約2 000～2 400 t[4]。中國海南地區[5]、中國福建地區[6]也都有種植。目前，國內外對香莢蘭豆香味成分研究已較為深入，郭彧等[1]研究發現香莢蘭豆原料中含有醛類、酚類、醇類、酸類、酯類、酮類等物質，其中最為主要的揮發性物質為香蘭素和愈創木酚。任洪濤等[7]采用同時蒸餾萃取方法收集了香莢蘭豆中的揮發性成分，對所得的揮發性成分的二氯甲烷濃縮液用氣相色譜-質譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）聯用技術對其進行分析，結果共鑒定出49 種化合物，其中含量較高的有2,3,5,6-四甲基苯酚（9.25%）、香蘭素（8.09%）、愈創木酚（7.93%）。陸舍銘等[8]用同時蒸餾萃取和固相微萃取作為2 種前處理方法并結合GC-MS聯用技術對其進行分析，結果得出2 種前處理方式中揮發性成分含量最高的均為香蘭素。但對不同產地香莢蘭豆的研究卻鮮見報道，故本實驗采用頂空固相微萃取（headspace solid phase micro extraction，HS-SPME）與GC-MS聯用技術對中國海南、科摩羅、馬達加斯加、中國福建、印度尼西亞5 個產地共15 個批次香莢蘭豆中揮發性成分進行鑒別，并結合化學計量法進行統計分析，建立快速分析香莢蘭豆揮發性成分的方法，并為香莢蘭豆的品質客觀評價指標提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

中國海南產香莢蘭豆（樣品編號為1、2、3）；科摩羅產香莢蘭豆（樣品編號為4、5、6）；馬達加斯加產香莢蘭豆（樣品編號為7、8、9）；中國福建產香莢蘭豆（樣品編號為10、11、12）；印度尼西亞產香莢蘭豆（樣品編號為13、14、15），由武漢黃鶴樓香精香料有限公司提供，經湖北中醫藥大學生藥教研室鑒定為蘭科香莢蘭屬植物香莢蘭的成熟果實。

1.2 儀器與設備

6890/5973型氣相色譜-質譜聯用儀 美國安捷倫公司；NIST系列標準譜庫、65 μm PDMS/DVB萃取頭、手動固相微萃取進樣器裝置、15 mL樣品瓶 美國Supelco公司；ALC-210.2電子天平 德國Sartorius公司。

1.3 方法

1.3.1 頂空固相微萃取條件

前期對藥材取樣量、平衡溫度、萃取溫度、平衡時間、萃取時間、萃取頭種類等因素進行考察，結果表明香莢蘭豆中香蘭素等主要風味物質在110 ℃條件下的相對含量最高，由此確定固相微萃取的最佳條件：即取香莢蘭豆2 g，剪碎，置于15 mL配有聚四氟乙烯膠墊的頂空瓶中，用帶有65 μm PDMS/DVB萃取纖維頭的手動進樣器插入瓶內，110 ℃平衡15 min，推出萃取頭頂空萃取15 min，取出，立即插入色譜儀進樣口（溫度250 ℃），解吸3 min。

1.3.2 GC-MS的分析

1.3.2.1 GC條件

色譜柱：HP-5MS石英毛細管色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；升溫程序：初始溫度為35 ℃，以6 ℃/min升至132 ℃，保留1 min，再以15 ℃/min升至147 ℃，再以10 ℃/min升至160 ℃，最后以15 ℃/min升至190 ℃；進樣口溫度：250 ℃；載氣：氦氣；流速：1 mL/min；進樣模式：不分流進樣。

1.3.2.2 MS條件

離子源：電子電離源；離子源溫度230 ℃；四極桿溫度150 ℃；電子能量70 eV；倍增管電壓1.2 kV；接口溫度280 ℃；質量掃描范圍m/z 35～550。

1.3.3 統計學處理

采用主成分分析和系統聚類分析2 種數據分析方法對各樣品的HS-SPME-GC-MS所得數據進行分析。

2 結果與分析

經化學工作站數據處理及用面積歸一化法從各總離子流圖（圖1）中計算各組分相對含量，按各峰的質譜圖經NIST譜庫檢索，確定各個組分，初步鑒定了104 種化合物，分析結果見表1。結果表明，不同產地的香莢蘭豆揮發性成分種類和相對含量有一定量的差異，但均含有香蘭素、愈創木酚、丁香酚、4-甲基愈創木酚、草蒿腦等18 種主要成分。香蘭素（4-羥基-3-甲氧基苯甲醛），又名香草醛、香草素、香蘭醛或香茅醛，是香子蘭豆莢中的一種主要成分，通常作為香料、天然藥物和醫藥中間體[9]，近年來研究又表明香蘭素具有抗菌性能[10-11]，并且已有研究發現以香蘭素為原料合成香豆酮和香蘭素衍生物新型席夫堿具有更強的抑菌效果[12-14]，除了作為增香劑外，香蘭素常作為含有多不飽和組分食品的抗氧化劑[15]。愈創木酚可以用來合成香蘭素，其生產量占整個香蘭素生產量的70%以上[16]，愈創木酚是一種重要的酚類香料[17]。丁香酚本身就是一種重要的風味代謝物，是形成香蘭素的前體物質[18]，還具有抗病毒、清除氧自由基功效[19]。4-甲基愈創木酚也是最重要的風味物質[20]。在得到的104 種揮發性成分中，15 個批次的香莢蘭豆含有的共有化合物有18 種，分別為香蘭素、愈創木酚、4-甲基愈創木酚、丁香酚、草蒿腦、α-蒎烯、糠醛、正辛醇、1-石竹烯、1-辛烯-3-醇、α-反式佛手柑油烯、肉桂酸甲酯、1-金剛烷醇、2-正丁基呋喃、對苯二甲醚、14-甲基十六烷酸甲酯、環十二酮、縮氨基硫脲、2,3,4-三甲基正己烷。以18 個共有峰的峰面積作為變量，得到15×18的數據矩陣，使用SPSS 19.0軟件進行主成分分析和聚類分析。

圖1 馬達加斯加香莢蘭豆總離子流圖Fig.1 Total ion chromatogram of Madagascar vanilla bean

2.1 主成分分析

將二維數據矩陣導入到SPSS 19.0軟件進行多變量統計分析。第1主成分的方差貢獻率為89.151%，第2主成分的方差貢獻率為10.607%，前2 個主成分的累計方差貢獻率為99.758%。一般來說，提取主成分的累積貢獻率達到80%～85%，可據此決定需要提取多少個主成分[21]。從圖2可知，印度尼西亞、科摩羅、馬達加斯加3 個產地的樣品在分布上相對集中，而中國海南、中國福建2 個產地的樣品在分布上相對集中，不同產地的樣品在分布上則有明顯差異。結果表明，采用主成分分析法能夠反映出不同產地香莢蘭豆成分差異，可以有效地

區分中國海南、科摩羅、馬達加斯加、中國福建、印度尼西亞的香莢蘭豆。

表1 15 個批次香莢蘭豆揮發性成分分析結果Table 1 Volatile components of 15 batches of vanilla bean

續表1

圖2 15 批香莢蘭豆樣品的主成分分析得分圖Fig.2 Principal component analysis of 15 batches of vanilla bean

2.2 系統聚類分析

利用SPSS 19.0軟件，采用Ward’s聚類法，以Euclidean距離為測度、峰面積百分率為基準，對15 個批次5 個產地的香莢蘭豆進行聚類分析。結果如圖3所示，樣本層次聚類分析聚成4 類，樣品1、2、3聚為一類，樣品4、5、6聚為一類，7、8、9聚為一類，樣品10、11、12聚為一類，13、14、15聚為一類。圖3直觀地顯示了整個聚類過程，縮小了憑借主觀判斷造成的誤差。聚類分析結果表明，不同產地的香莢蘭豆具有明顯的內在差異，同一產地的香莢蘭豆在化學成分上具有相似性。

圖3 15 批次香莢蘭豆樣品的聚類分析結果Fig.3 Cluster analysis of 15 batches of vanilla bean

3 討 論

采用HS-SPME-GC-MS聯用技術對中國海南、科摩羅、馬達加斯加、中國福建、印度尼西亞5 個產地的香莢蘭豆進行分析，該方法前處理簡單，無需采用有機試劑，樣品用量少，快速準確。共鑒定出了104 種化合物，18 種為共有成分，其中相對含量最高的為香蘭素，5 個產地香蘭素的平均含量分別為30.97%、48.14%、51.83%、23.73%、42.09%，馬達加斯加產香莢蘭豆中香蘭素的含量明顯高于印度尼西亞、中國海南、中國福建3 個產地，略高于科摩羅，可能是由于香莢蘭豆的種植土壤、氣候等生境條件不同，使植物次生代謝過程存在差異。

采用主成分分析法和聚類分析法2 種化學模式識別方法對HS-SPME-GC-MS分析所得數據進行處理，該方法不僅可以綜合地反映相同產地香莢蘭豆間的相似關系，而且可以全面地反映不同產地藥材間的差異，使分析結果更為直觀、客觀。

[1] 郭彧. 香莢蘭豆揮發性成分及其質量標準研究[D]. 武漢: 湖北中醫藥大學, 2013.

[2] HANSEN E H, M±LLER B L, KOCK G R, et al. De novo biosynthesis of vanillin in fission yeast (Schizosaccharomyces pombe) and baker’s yeast (Saccharomyces cerevisiae)[J]. Applied and Environmental Microbiology, 2009, 75(9): 2765-2774.

[3] 喻林. 桑腸桿菌VL4-3轉化阿魏酸生產香蘭素的研究[D]. 武漢: 湖北大學, 2012: 36.

[4] 趙麗青. 微生物法轉化異丁香酚生成香草醛的研究[D]. 無錫: 江南大學, 2006: 19.

[5] 董智哲, 谷風林, 徐飛, 等. 固相微萃取和同時蒸餾萃取法分析海南香草蘭揮發性成分[J]. 食品科學, 2014, 35(2): 158-163.

[6] 丁靖塏, 孫漢董, 吳玉, 等. 國產香莢蘭豆不同方法處理后的香氣成分比較分析[J]. 香料香精化妝品, 1987, 36(2): 37-38.

[7] 任洪濤, 周斌. 云南香莢蘭揮發性成分研究[J]. 熱帶農業科技, 2007, 30(1): 25-30.

[8] 陸舍銘, 曲國福, 孟昭宇, 等. GC/MS法分析香莢蘭豆酊成分[C]//甘青寧色譜協作中心, 甘肅省化學會色譜委員會. 首屆中國中西部地區色譜學術交流會暨儀器展覽會論文集. 蘭州: 甘青寧色譜協作中心, 甘肅省化學會色譜委員會, 2006: 3.

[9] 陳朋, 李紅玉, 梁寧, 等. 香蘭素的起源及生產技術進展[C]//2008中國香蘭素及其上下游產業發展論壇論文集. 北京: 中國化工報社, 2008: 187-195.

[10] 周慶禮, 張智維, 王昌祿, 等. 香蘭素抑菌作用的研究[J]. 食品科學, 2005, 26(增刊1): 23-25.

[11] CAVA-RODA R M A, TABOADA-RODR G A, VALVERDEFRANCO M A T, et al. Antimicrobial activity of vanillin and mixtures with cinnamon and clove essential oils in controlling Listeria monocytogenes and Escherichia coli O157:H7 in milk[J]. Food Bioprocess Technology, 2012, 5(6): 2120-2131.

[12] YU Qianyan, ZHANG Bo, WANG Lin, et al. Induction of apoptosis and autophagic cell death by the vanillin derivative 6-bromine-5-hydroxy-4-methoxybenzaldehyde is accompanied by the cleavage of DNA-PKcs and rapid destruction of c-Myc oncoprotein in HepG2 cells[J]. Cancer letters, 2007, 252(2): 280-289.

[13] HARINI S T, KUMAR H V, RANGASWAMY J, et al. Synthesis, antioxidant and antimicrobial activity of novel vanillin derived piperidin-4-one oxime esters: preponderant role of the phenyl ester substituents on the piperidin-4-one oxime core[J]. Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters, 2012, 22(24): 7588-7592.

[14] YEMIS G P, PAGOTTO F, BACH S, et al. Effect of vanillin, ethyl vanillin, and vanillic acid on the growth and heat resistance of Cronobacter species[J]. Journal of Food Protection, 2011, 74(12): 2062-2069.

[15] 王潔. 一種芽孢桿菌J4-1發酵生產香蘭素的研究[D]. 武漢: 湖北大學, 2012: 21.

[16] 唐亞楠. 香蘭素及其衍生物的制備技術研究[D]. 廣州: 華南理工大學, 2012: 32.

[17] 趙冰, 任琳, 陳文華, 等. 煙熏工藝對熏肉揮發性風味物質的影響[J].食品科學, 2013, 34(6): 180-187.

[18] 孫愛東. 蘋果汁加工中典型芳香成分的形態、變化及香氣調控的研究[D]. 泰安: 山東農業大學, 2002: 47.

[19] 黃羅生, 顧燕飛, 李紅. 中藥揮發油及芳香性藥物的研究進展[J]. 中國中藥雜志, 2009, 34(12): 1605-1611.

[20] 陳鑫炳, 范素琴. 臘肉風味的研究[J]. 肉類工業, 2010, 18(2): 31-34.

[21] 馬威, 方瑩. BP網絡模型在財務危機預警中的應用[J]. 財會月刊, 2009, 5(6): 51-54.

Analysis of Volatile Components of Vanilla Beans from Different Habitats by HS-SPME-GC-MS

Objective: To analyze the volatile components of vanilla beans from different habitats. Methods: The contents of volatile components from vanilla beans were determined by peak area normalization method. The separated volatile components were identified by GC-MS. Results: Totally 104 volatile components were identified preliminarily. There were differences in volatile components of vanilla beans from different habitats. Conclusion: The analytical method presented in this study is reliable and stable and can be applied for the analysis of volatile components of vanilla beans.

vanilla bean; volatile components; headspace solid phase micro extraction; cluster analysis; principal component analysis

R284.1

A

1002-6630（2014）22-0247-05

10.7506/spkx1002-6630-201422048

2014-03-07

黎強（1990—），男，碩士研究生，主要從事中藥及其天然產物活性成分研究。E-mail：18986157273@163.com

*通信作者：盧金清（1955—），男，教授，學士，主要從事中藥及其天然產物活性成分研究。E-mail：ljq59169@sohu.com

LI Qiang, LU Jin-qing*, GUO Sheng-nan, CAI Jun-long, LI Xiao-shuang

(Hubei Medicinal Plants Co-Laboratory of Universities and Enterprises, Hubei University of Chinese Medicine, Wuhan 430065, China)