酵母菌葡萄糖耐量因子的純化

孔凡華，劉 鷺，張書文，蘆 晶，李紅娟，薛海曉，趙麗麗，周志江,*，呂加平,*

（1.天津大學化工學院，天津 300072；2.中國農業科學院農產品加工研究所，北京 100193）

酵母菌葡萄糖耐量因子的純化

孔凡華1，劉 鷺2，張書文2，蘆 晶2，李紅娟2，薛海曉2，趙麗麗2，周志江1,*，呂加平2,*

（1.天津大學化工學院，天津 300072；2.中國農業科學院農產品加工研究所，北京 100193）

以高鉻酵母菌粉為研究對象，采用溫和的純化方法，通過氨水提取高鉻酵母菌粉中的酵母菌葡萄糖耐量因子（glucose tolerance factor，GTF），聯用SuperdexTM75和Sephadex G25凝膠過濾層析對提取物進行粗分離，然后用反相高效液相色譜對提取物進行再分離，從而對GTF進行高效純化研究。將GTF純化品作用于胰島素抵抗型3T3-L1脂肪細胞，通過檢測細胞葡萄糖消耗量，分析GTF純化品對細胞葡萄糖代謝調節活性。研究表明，GTF純化品可以有效提高胰島素抵抗型3T3-L1脂肪細胞葡萄糖的消耗?？梢?，經過多步柱層析純化后，可以得到具有葡萄糖代謝調節活性的GTF純化品 。

酵母菌葡萄糖耐量因子；高鉻酵母粉；純化；胰島素抵抗型3T3-L1脂肪細胞；葡萄糖代謝

近年來，隨著人們生活水平的提高，糖尿病的發病率迅速增長。糖尿病患者體內微量元素鉻含量明顯低于健康人[1-3]，臨床研究表明，補鉻對治療不同類型的糖尿?。á裥吞悄虿　ⅱ蛐吞悄虿　⑷焉锾悄虿『皖惞檀家鸬奶悄虿〉? 均有效[4-7]。酵母菌葡萄糖耐量因子（glucose tolerance factor，GTF）是一種高活性的鉻補充物，它是小分子的鉻結合物質，三價有機鉻是其重要活性中心，含有半胱氨酸、天門冬氨酸、甘氨酸和谷氨酸[8]，GTF能提高胰島素的活性，促進胰島素與細胞膜受體結合，利于機體組織對葡萄糖的吸收[9]。脂肪組織是胰島素的重要外周靶器官，在胰島素抵抗和Ⅱ型糖尿病的發病中起重要作用[10]。

國內外許多研究者對GTF分離純化工作進行了研究，Davies等[11]使用DEAE-cellulose分離純化酵母氨水提取物，結果顯示陰、陽組分皆有 GTF 活性及鉻。Edens等[12]利用C18反相層析和離子對反相高效液相色譜對酵母提取物進行純化研究，得到3 個結構組分復雜的分離物。Liu lu[13-14]和Vincent[15]等通過凝膠過濾層析和高效液相色譜對酵母氨水提取物進行分步分離，得到m/z比值分別為712.253 5和769.274 7的鉻結合物，但沒有對鉻結合物進行活性分析。盡管從酵母中純化GTF的研究工作已經有近60 年的歷史，研究者采用不同的分離方法純化出一些鉻絡合物，但到目前為止，仍沒有純化出GTF純品，GTF的結構沒有得到完全解析，并且由于純化條件的苛刻（用強酸提取或強極性樹脂分離）[16-17]，可能導致純化后的GTF失去生物活性。本實驗在前人研究的基礎上嘗試通過溫和的純化方法：氨水提取[18]、凝膠過濾層析和反相高效液相色譜（reversed phase high performance liquid chromatography，RP-HPLC）對酵母菌葡萄糖耐量因子進行純化研究，以3T3-L1胰島素抵抗型脂肪細胞[19]為評價模型，觀察GTF對脂肪細胞葡萄糖消耗的影響，分析其對細胞葡萄糖代謝調節活性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

3T3-L1前脂肪細胞株，購自中國協和醫科大學細胞庫。

地塞米松、3-異丁基-1-甲基-黃嘌呤（3-isobutyl-1-methylxanthine，IBMX）、胰島素 美國Sigma公司；高糖DMEM培養基、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）、胎牛血清 美國Corning公司；胰蛋白酶 美國Gibco公司；SuperdexTM75和Sephadex G25美國GE公司；鉻標準液（1 000 μg/mL） 中國計量科學院；硝酸、高氯酸均為優級純；三氯化鉻、氨水、葡萄糖等均為國產分析純；酵母浸粉、大豆蛋白胨、瓊脂粉為生化試劑；分析用水為去離子水。

1.2 儀器與設備

CXG常壓生物電腦層析系統 上海滬西分析儀器廠；UV2300分光光度計 上海天美科學儀器有限公司；MDS-6微波消解/萃取儀 上海新儀微波化學科技有限公司；SIGMA 3K-15離心機 美國Sigma公司；AA6300火焰原子吸收分光光度計 日本島津公司；DL-CJ-IN高性能無菌試驗臺 哈爾濱市東聯公司；TSAO HSINTH-3560高壓滅菌鍋 造鑫企業有限公司；YP2001N電子天平 上海精密科學儀器有限公司；HZQ-F160搖床培養箱 哈爾濱市東聯公司；BIOTECH-50BG自動控制發酵罐 上海保興生物設備工程有限公司；RE52-99旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；Virtis Genesis冷凍干燥機 美國Virtis公司；1525 Binary HPLC系統 美國Waters公司。

1.3 方法

1.3.1 酵母菌葡萄糖耐量因子的粗提

通過50 L發酵罐發酵工藝制備高鉻酵母菌體[20]，冷凍干燥得高鉻酵母菌粉。氨水提取菌粉中有機鉻[18]，旋轉蒸發濃縮處理后，冷凍干燥備用。

1.3.2 SuperdexTM75凝膠過濾層析條件

去離子水溶解高鉻酵母菌粉氨水提取物，離心后上規格為1.6 cm×60 cm的SuperdexTM75凝膠過濾層析柱，以50 mmol/L醋酸氨和0.15 mol/L氯化鈉（pH 6.0）混合液作為洗脫液，洗脫流速為0.3 mL/min，每10 min收集一管洗脫液，共收集60管，用紫外分光光度計在254 nm波長處對各管洗脫液進行檢測，微波消解，參照GB/T 15555.6—1995《固體廢物 總鉻的測定 直接吸入火焰原子吸收分光光度法》測定洗脫液中的鉻含量，收集第2個鉻峰洗脫液，冷凍干燥備用。

1.3.3 Sephadex G25凝膠過濾層析條件

去離子水溶解冷凍干燥的SuperdexTM75凝膠過濾層析第2個鉻峰洗脫液，過膜后上規格為1.6 cm×80 cm的Sephadex G25 凝膠過濾層析柱，以去離子水為洗脫液，洗脫流速為0.3 mL/min，每10 min收集一管洗脫液，共收集70 管，用紫外分光光度計在254 nm波長處對各管洗脫液進行檢測，微波消解，測定洗脫液中鉻含量，收集鉻峰，冷凍干燥備用。

1.3.4 反相高效液相色譜條件

去離子水溶解冷凍干燥的Sephadex G25凝膠過濾層析鉻峰洗脫液，進一步用反相高效液相色譜制備性層析柱純化，色譜柱為XBridgeTMC18色譜柱（10 mm×250 mm，10 μm），流動相A液，乙腈-三氟乙酸（trifluoroacetic acid，TFA）體積比1 000∶0.8，B液，水-TFA體積比1 000∶1。采用梯度洗脫的方法，洗脫15 min，乙腈20%～22%，洗脫流速為1.5 mL/min，每30 s收集一管洗脫液，共收集30 管，在254 nm波長處對每管洗脫液進行檢測，微波消解，測定洗脫液中鉻含量。收集鉻峰，繼續用反相高效液相色譜制備性層析柱分離，采用梯度洗脫的方法，洗脫12 min，乙腈60%～100%，洗脫流速為2 mL/min，每30 s收集1 管洗脫液，共收集24 管，在254 nm波長處對每管洗脫液進行檢測，微波消解，測定洗脫液中鉻含量。

1.3.5 GTF對胰島素抵抗型3T3-L1脂肪細胞葡萄糖消耗的影響

3T3-L1前脂肪細胞接種于24 孔培養板，待細胞匯合后接觸抑制48 h，換用含10 mg/L胰島素、0.5 mmol/L IBMX、1 μmol/L地塞米松培養基培養48 h，然后換用含10 mg/L胰島素培養基培養48 h，繼續用DMEM高糖培養基培養[21]，每2 d換液1 次，培養8～12 d，前脂肪細胞可分化為成熟脂肪細胞。將成熟脂肪細胞用10-7mmol/L胰島素誘導處理48 h使其成為胰島素抵抗型細胞[19,22]。用純化后的GTF作用抵抗型細胞，通過加或不加胰島素（10-7mmol/L）共同作用24 h，以鉻添加量反映GTF添加量，觀察GTF對細胞葡萄糖消耗的影響。

2 結果與分析

2.1 SuperdexTM75凝膠過濾層析結果

254 nm是GTF的特征吸收波長，鉻是GTF的活性中心，因此本實驗采用同時檢測254 nm波長處吸光度和鉻含量來分析GTF的分布。由圖1可知，高鉻酵母粉氨水提取物經SuperdexTM75凝膠過濾層析后，得到3 個A254nm峰，2 個鉻峰。酵母氨水提取物中組分比較復雜，一些雜質也會在A254nm波長時有較大吸光度，因此根據鉻峰判斷洗脫液中GTF的分布更有指導意義。根據凝膠層析分離原理，大分子物質先于小分子物質洗脫出來，故第1個鉻峰為大分子鉻蛋白，第2個鉻峰為小分子鉻蛋白。盡管目前為止還沒有 GTF分子質量的確切報道，但國內外學者對酵母提取物分離純化研究結果均表明[8,13,15,23]，GTF 為小分子物質，因此可以判斷，第2個鉻峰為實驗目標物，因此收集第2個鉻峰洗脫液，冷凍干燥備用。

圖1 SuperdexTM75凝膠過濾層析Fig.1 Purif i cation with SuperdexTM75 gel chromatographic

2.2 Sephadex G25凝膠過濾層析結果

圖2 Sephadex G25凝膠過濾層析Fig.2 Purif i cation with Sephadex G25 gel chromatography

收集SuperdexTM75第2個鉻峰洗脫液，過Sephadex G25凝膠過濾層析柱，得到5 個A254nm峰，1 個鉻峰。其中鉻峰與第2個A254nm峰吻合。可見通過SuperdexTM75和Sephadex G25凝膠過濾層析，可以去除大量雜蛋白，GTF得到初步純化。在此基礎上，本實驗繼續用RP-HPLC對鉻峰進行純化，以分析其純度，并對鉻峰高效率分離。

2.3 RP-HPLC第1次純化

圖3 RP-HPLC第1次純化Fig.3 First purif i cation by RP-HPLC

由圖3可知，經反相高效液相分離后得到3 個A254nm峰，1 個鉻峰，鉻峰和第1個A254nm峰重合?？梢奀18柱對GTF進行了有效分離，去除了與GTF分子質量相近的蛋白組分，對GTF的進一步分離起到很好的純化效果。

2.4 RP-HPLC第2次分離純化

圖4 RP-HPLC第2次純化Fig.4 Second purif i cation by RP-HPLC

為分析RP-HPLC對GTF的純化效果及所得鉻峰的純度，收集第1次RP-HPLC鉻峰洗脫液，繼續用RP-HPLC進一步純化，如圖4所示，在整個洗脫過程中，只出現一個A254nm峰和一個鉻峰，兩峰重合且對稱分布。綜上所述，通過聯用SuperdexTM75、Sephadex G25凝膠過濾層析和反相高效液相色譜純化，可以得到GTF純品。

2.5 GTF對胰島素抵抗型3T3-L1脂肪細胞葡萄糖消耗的影響

圖5 GTF對胰島素抵抗型3T3-L1脂肪細胞葡萄糖消耗的影響Fig.5 Effect of GTF on glucose consumption of insulin-resistant 3T3-L1 adipocytes

文獻報道GTF能提高胰島素的活性功能，促進胰島素與細胞膜受體結合，協同胰島素一起參與人體糖和脂質代謝[9-10]。3T3-L1脂肪細胞是功能性評價中典型的模式細胞。本實驗通過胰島素和高糖培養基培養方法，誘導3T3-L1脂肪細胞成為胰島素抵抗細胞模型，模擬Ⅱ型糖尿病環境，以研究葡萄糖耐量因子對體外脂肪細胞葡萄糖代謝的影響。如圖5所示，對胰島素抵抗型細胞，單獨加GTF時，隨著GTF添加量的增加，細胞葡萄糖消耗量呈一定的遞增趨勢，這可能是由于GTF通過p38 MAPK途徑促進了細胞葡萄糖的消耗[24]。當GTF與胰島素共同作用于細胞時，細胞葡萄糖消耗量顯著增加，呈劑量依賴效應，當細胞培養液中鉻質量濃度為1 μg/mL時，細胞葡萄糖消耗量可以提高2.5 倍，可見，分離純化得到的GTF純品，具有顯著調節葡萄糖代謝的活性。

3 結 論

本實驗用氨水提取高鉻酵母菌粉中葡萄糖耐量因子，通過SuperdexTM75、Sephadex G25凝膠過濾層析和反相高效液相色譜對其進行純化，得到GTF純品。通過胰島素抵抗型3T3-L1脂肪細胞評價純化所得GTF對細胞葡萄糖代謝的調節作用，結果表明：在胰島素存在時，GTF可以顯著提高細胞葡萄糖消耗量，且呈劑量依賴效應。可見，通過聯用SuperdexTM75和Sephadex G25凝膠過濾層析和反相高效液相色譜，可以對GTF進行有效分離，純化所得GTF樣品具有顯著葡萄糖代謝調節活性。

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Purif i cation of Glucose Tolerance Factor (GTF) from High-Chromium Yeast

KONG Fan-hua1, LIU Lu2, ZHANG Shu-wen2, LU Jing2, LI Hong-juan2, XUE Hai-xiao2, ZHAO Li-li2, ZHOU Zhi-jiang1,*, Lü Jia-ping2,*
(1. School of Chemical Engineering and Technology, Tianjin University, Tianjin 300072, China; 2. Institute of Agro-products Processing Science and Technology, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100193, China)

In this study, a mild extraction procedure was used to purify glucose tolerance factor (GTF) from high-chromium yeast cells. GTF was extracted by ammonia from high-chromium yeast cells. SuperdexTM75 and Sephadex G25 gel fi ltration chromatography were adopted to purify the extracts. Reverse phase high-performance liquid chromatography (RP-HPLC) was used for further purif i cation. The glucose metabolism regulating activity of GTF was evaluated in insulin-resistant 3T3-L1 adipocytes. This research showed that through multiple steps of column chromatography, the pure GTF was obtained, which could improve glucose metabolism in insulin-resistant 3T3-L1 adipocytes.

yeast glucose tolerance factor; high-chromium yeast; purif i cation; insulin-resistant 3T3-L1adipocytes; glucose metabolism

Q939.99

A

1002-6630（2014）21-0001-04

10.7506/spkx1002-6630-201421001

2013-12-05

國家自然科學基金面上項目（31371763）

孔凡華（1989—），女，碩士研究生，主要從事食品微生物研究。E-mail：kkfanhua@126.com

*通信作者：周志江（1960—），男，教授，博士，主要從事食品安全與食品生物技術研究。E-mail：zzj@tju.edu.cn呂加平（1963—），男，研究員，博士，主要從事食品微生物與發酵工程研究。E-mail：lvjp586@vip.sina.com