大劑量高壓氧超早期治療對局部腦梗死大鼠細胞凋亡的影響

于秋紅，李婕，劉亞玲，郁軍超，薛連璧

神經(jīng)保護是腦梗死的治療策略之一，也是腦血管病領域的研究熱點之一。有研究提示高壓氧（hyperbaric oxygenation，HBO）治療能促進腦血管側(cè)支循環(huán)建立[1]，且有直接神經(jīng)保護作用，可保護缺血半暗帶休眠腦細胞[2]。我們前期實驗[3]提示大劑量HBO超早期治療永久性大腦中動脈阻塞（middle cerebral artery occlusion，MCAO）大鼠，可能在抑制、阻斷，甚至逆轉(zhuǎn)其腦缺血后病理變化方面具有一定的作用，通過提高內(nèi)源性血管內(nèi)皮因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）促進側(cè)支循環(huán)建立，減小腦梗死體積可能是其機制之一。有研究[4]顯示高壓氧可以通過抑制一氧化碳中毒大鼠海馬神經(jīng)細胞線粒體膜電位（mitochondrial membrane potential，MMP）降低來影響細胞凋亡，但對腦梗死大鼠是否具有同樣作用，目前尚無研究。基于此，我們采用HBO單次9 h方案治療超早期局部腦梗死大鼠，觀察HBO對細胞凋亡和膜電位的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 清潔級雄性SD大鼠72只，重量（280±20）g，由北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司提供，實驗前大鼠禁食不禁水3 h以上。

1.2 試劑 北京化學試劑公司生產(chǎn)水合氯醛、2，3，5苯四氮唑（tetrazolium chloride，TTC）、蔗糖，南京凱基生物科技發(fā)展有限公司出品多聚甲醛（Cat#KGT558）、磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS，Cat#KGT549）、檸檬酸鈉（Cat#KGT553）、聚乙二醇辛基苯基醚（Triton X-100，Cat#KGT551）、脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶介導的缺口末端標記法（terminaldeoxynucleotidyl transferase mediated nick end labeling，TUNEL）試劑盒（Cat#KGA7044，含緩沖液、熒光素標記的脫氧尿嘧啶核苷三磷酸、脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶、抗熒光素抗體、辣根過氧化酶底物二氨基聯(lián)苯胺顯色劑）、細胞懸液制備試劑盒（Cat#KGA829）、羅丹明123染色試劑盒（Cat#KGA217）。

1.2 模型制作及分組 采用改良的Zea-longa線栓法[5]制作大鼠永久性MCAO模型，選擇阻塞左側(cè)大腦中動脈，模型制作后3 h采用姿勢反射實驗對大鼠進行行為學評分（3分制）[6]，評分≥1分的動物視為造模成功，排除麻醉未清醒、死亡、無自主行動大鼠和無神經(jīng)功能缺損大鼠，造模成功的大鼠隨機分為對照組（n=36）和HBO組（n=36）。

1.3 實驗方法 采用上海減壓器廠生產(chǎn)的透明純氧動物實驗艙。HBO組動物于MCAO后3 h內(nèi)開始HBO。治療壓力為0.2 MPa。升壓20 min，穩(wěn)壓9 h，減壓40 min。為避免氧中毒，大鼠分別于1 h、3 h、5 h、7 h、9 h呼吸純氧，2 h、4 h、6 h、8 h呼吸艙內(nèi)高壓空氣。對照組大鼠于MCAO后，呼吸常壓空氣。

1.4 觀察指標 ①神經(jīng)功能評分：采用Garcia評分標準[7]在MCAO后3 h、13 h、72 h對大鼠行為學進行評價。②腦梗死體積：大鼠于缺血后13 h、72 h斷頭取腦，各時間點每組取6只大鼠，全腦于冷凍狀態(tài)下切成5片，每片冠狀切片厚度2 mm。對腦組織進行TTC染色后測定各組腦梗死體積，正常腦組織染成粉紅或紫紅色，梗死灶染成白色。用ⅠmageJ軟件對每只大鼠腦組織梗死面積、半球面積進行定量測定，為除去梗死部位組織水腫帶來的誤差，采用校正的梗死面積測定公式，即梗死面積=右側(cè)半球面積－（左側(cè)半球面積－測定的左側(cè)半球梗死面積）[8]。梗死容積=Σ（相鄰兩片腦組織梗死面積相加×1/2×層厚）。考慮到不同體重大鼠的腦組織的基線重量不同，所以計算相對梗死容積，即梗死容積占大腦總?cè)莘e的百分比[8]。③凋亡細胞數(shù)：于模型制成后13 h、72 h取材，每組取6只大鼠麻醉，生理鹽水、4%甲醛灌注，取前囟后3～6 mm處腦組織冷凍切片后行TUNEL染色，按TUNEL染色說明書操作，將厚度為20 μm冷凍切片浸入通透液，冰上促滲2 min，PBS沖洗3次，滴加脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶反應液，置于濕盒中37℃反應60 min，PBS沖洗3次后熒光顯微鏡觀察，各組均可見標記為綠色熒光的TUNEL陽性細胞，各樣本隨機選取5個缺血半暗帶視野觀察，計數(shù)視野中的陽性細胞數(shù)，取平均數(shù)。④線粒體膜電位：大鼠于缺血后13 h、72 h斷頭取腦，每組各時間點取6只大鼠，將缺血半暗帶腦組織[9]剪成糊糜，加入消化酶A消化25 min，經(jīng)過漂洗、吹打、研磨、過濾、離心制成細胞懸液，加入羅丹明123染液，按說明書操作，孵育、離心、重懸細胞培養(yǎng)、離心、再重懸，流式細胞儀檢測羅丹明123熒光強度以觀察膜電位變化情況，激發(fā)波長488～505 nm，發(fā)射波長515～575 nm。熒光值越高，表示線粒體跨膜電位越低，反映線粒體功能越差，正常值為1067.96。

1.5 統(tǒng)計學分析 采用SPSS 16.0統(tǒng)計軟件分析。計量資料符合正態(tài)分布，以s表示，同組間不同時間點比較采用相關樣本t檢驗，兩組比較采用兩獨立樣本t檢驗。以P＜0.05為有顯著差異。

2 結(jié)果

對照組大鼠死亡7只，13 h內(nèi)2只，13～24 h、24～48 h、48～72 h內(nèi)分別死亡1只、2只和2只，經(jīng)解剖證實死因分別為腦出血、腦水腫和蛛網(wǎng)膜下腔出血，剔除數(shù)據(jù)后重新補充模型。HBO組治療過程中無死亡、癲癇發(fā)生。

2.1 神經(jīng)功能評分 兩組各時間點Garcia評分比較見表1。由表1可見，與3 h相比，各組大鼠在MCAO 13 h時神經(jīng)功能較MCAO 3 h時即有明顯改善（P均=0.007），72 h時改善有更明顯的趨勢（P均＜0.001），但72 h時與13 h時比無顯著差異。各時間點對照組與HBO組相比，神經(jīng)功能無顯著差異。

2.2 腦梗死容積 可以觀察到梗死灶主要位于左側(cè)MCA分布區(qū)的皮層、皮層下白質(zhì)和基底節(jié)區(qū)。各組腦梗死容積比符合正態(tài)分布，對照組13 h、72 h時梗死容積百分比分別為（15±5.2）%、（28±5.3）%，HBO組大鼠13 h、72 h時梗死容積比分別為（11±3.0）%、（15±7.3）%，缺血13 h時兩組大鼠腦梗死容積比無顯著差異，72 h時對照組腦梗死容積比較13 h時增大（P=0.02），HBO組腦梗死容積比較對照組小，差異有顯著性（P=0.02）。

2.3 凋亡細胞數(shù) 缺血半暗帶區(qū)可見大量凋亡細胞，13 h時凋亡細胞數(shù)HBO組較對照組少，差異有顯著性（P=0.04），72 h時兩組的凋亡細胞數(shù)無顯著差異（P=0.92）。對照組72 h時凋亡細胞數(shù)少于13 h時，差異有顯著性（P=0.03），HBO組72 h時與13 h時無顯著差異（P=0.47），詳見表2。

2.4 線粒體膜電位 從MCAO后13 h開始，對照組熒光值升高，提示線粒體膜電位下降，至72 h無明顯變化（P=0.76）。HBO組熒光值相對穩(wěn)定于較低水平，提示線粒體膜電位穩(wěn)定于較高水平，72 h與13 h比，無顯著差異（P=0.58）。對照組各時間點膜電位均低于HBO組（P＜0.001）（表3）。

表1 各組大鼠Garcia評分比較

3 討論

目前的動物實驗顯示HBO治療永久性腦動脈阻塞模型結(jié)論存在爭議，HBO時間窗和劑量是療效差異的關鍵。有文獻表明，幕上非腔隙性梗死的病理演變時間是6～18 h，平均約10 h[10]。基于上述理論，我們采用9 h HBO在3 h內(nèi)開始治療永久性MCAO大鼠，力求阻止，甚至逆轉(zhuǎn)卒中的病理演變過程。本研究和前期結(jié)果[3，11]類似，顯示了單次9 h HBO能改善局部腦梗死大鼠神經(jīng)功能，縮小腦梗死容積。缺血周圍區(qū)存在部分休眠細胞，及時供氧可能挽救其功能，反之，則發(fā)生細胞凋亡或壞死。細胞凋亡是個主動耗能過程，需要三磷酸腺苷（adenosine triphosphate，ATP）供能，ATP的缺乏將直接阻斷凋亡通路，使細胞轉(zhuǎn)向壞死[12-13]，進而擴大梗死容積。ATP的主要來源是線粒體，從理論上講，如果能促進線粒體產(chǎn)生ATP，則可減少細胞壞死，縮小梗死容積。線粒體膜電位是線粒體進行氧化磷酸化產(chǎn)生ATP的先決條件，膜電位下降，標志著細胞不可逆損傷的開始[14]。李強等[15]發(fā)現(xiàn)缺血后腦組織線粒體存在短暫的內(nèi)源性代償修復機制，但不足以逆轉(zhuǎn)氧化應激對線粒體的持續(xù)損傷。Li等[13]應用培養(yǎng)的海馬細胞證實減少氧自由基聚集，可以抑制膜電位的降低，從而抑制細胞壞死。一方面，HBO提高梗死周圍組織氧供[16]，增加線粒體的ATP含量，從而減少細胞壞死，減輕組織損傷，另一方面又產(chǎn)生氧自由基，對膜電位到底有何影響，目前的研究尚未得出結(jié)論。

表2 各組凋亡細胞計數(shù)比較（個）

表3 各組線粒體的羅丹明123熒光強度比較

本研究結(jié)果顯示大劑量HBO后，膜電位持續(xù)穩(wěn)定于較高水平，缺血半暗帶區(qū)凋亡細胞數(shù)在13 h降低，考慮HBO提供了充足的氧供，挽救了休眠細胞，所以凋亡細胞數(shù)減少。而72 h后，兩組凋亡細胞幾近相等，推測原因：一是MCAO后部分細胞壞死，故而凋亡數(shù)量減少，二是HBO持續(xù)作用時間有限，未能覆蓋缺血灶病理生理變化的全過程。本研究中HBO組大鼠72 h時腦梗死體積與13 h無顯著性差異，提示細胞發(fā)生凋亡，所以梗死體積變化不大，而對照組72 h時梗死體積較13 h明顯擴大，考慮此階段細胞壞死，故而梗死體積擴大，這與本研究凋亡細胞數(shù)及線粒體膜電位的變化趨勢也是相符的，提示缺血超早期提供充足氧供，減少細胞凋亡，有助于縮小梗死容積，通過線粒體途徑影響細胞凋亡，可能是HBO的機制之一。本課題組以前的研究[17]發(fā)現(xiàn)，雖然9 h HBO可能增加了腦組織中某些自由基的含量，但不僅沒有加重過氧化損傷水平，反而顯著降低了實驗大鼠腦組織的過氧化損傷程度，可能是HBO產(chǎn)生的神經(jīng)保護作用比自由基產(chǎn)生的損傷作用更強大。

此外，還有其他體內(nèi)體外的研究證實HBO可以通過線粒體途徑影響細胞凋亡。Weber等[18]將T細胞暴露于高壓氧氣中，發(fā)現(xiàn)1次30 min的HBO暴露即可通過線粒體機制引起淋巴細胞凋亡。而Bai等[19]則認為HBO治療早期急性胰腺炎大鼠，正是通過線粒體途徑引起外周血淋巴細胞凋亡，抑制了炎性反應，從而降低了大鼠胰腺炎的程度。其機制包括凋亡誘導因子[13]轉(zhuǎn)位、神經(jīng)蛋白[20]等，有關機制本課題組亦將繼續(xù)研究。

本研究尚存以下局限：①觀察點較少，觀察時間短，可能不足以反映腦梗死過程中各指標的演變過程；②樣本量小；③由于缺血半暗帶是一個動態(tài)變化的區(qū)域，故取材定位的缺血半暗帶與實際的缺血半暗帶可能存在差距。

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