HPLC 法測定復方吡拉西坦腦蛋白水解物片中硫酸軟骨素鈉的含量

劉志輝（梅州市食品藥品監督檢驗所，廣東梅州 514071）

復方吡拉西坦腦蛋白水解物片為復方制劑，主要成分為吡拉西坦、腦蛋白水解物、谷氨酸、硫酸軟骨素鈉、維生素B1、維生素B2、維生素B6、維生素E；適用于急慢性腦血管病、腦外傷、各種中毒性腦病等原因引起的腦神經功能障礙及記憶力減退、先天性腦發育不全、兒童智能發育遲緩、老年性癡呆等的治療[1]。其中硫酸軟骨素鈉主要為N-乙酰半乳糖胺（2-乙酰胺-2-脫氧-β-D-吡喃半乳糖）和D-葡萄糖醛酸的共聚物的硫酸酯鈉鹽，共聚物內己糖通過β-1，3及β-1，4糖苷鍵交替連接。復方吡拉西坦腦蛋白水解物片中硫酸軟骨素鈉測定方法現行標準是分光光度法[2]：利用鹽酸水解供試品生成氨基己糖，然后在堿性條件下與乙酰丙酮反應，生成色原物質，再與對二甲氨基苯甲醛溶液反應產生紅色，以氨基葡萄糖為對照品，用分光光度法在525 nm 波長處測吸光度，乘以系數0.830 9 計算氨基葡萄糖的量。該法水解產生的氨基己糖系一種氨基半乳糖，半乳糖是一種由6個碳和1個醛組成的單糖，歸類為醛糖和己糖；葡萄糖是己醛糖，氨基半乳糖與氨基葡萄糖的分子式相同，但結構式是完全不同的，因此該分光光度法不僅不能準確測定硫酸軟骨素鈉的主體結構的真實含量，而且結果重現性不好[3]。筆者參考文獻[4-8]，建立了采用高效液相色譜（HPLC）法測定復方吡拉西坦腦蛋白水解物片中硫酸軟骨素鈉含量的方法，結果表明該方法靈敏度高、專屬性強、操作簡單、結果準確，可為控制該藥品的質量提供參考。

1 材料

1.1 儀器

1200型HPLC儀、紫外檢測器（美國Agilent公司）。

1.2 藥品與試劑

硫酸軟骨素鈉對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：140792-201001，純度：100%）；樣品為復方吡拉西坦腦蛋白水解物片（復方制劑，白求恩醫科大學制藥廠二分廠，批號：20130620、20121013、20131102，規格：每片含硫酸軟骨素鈉20 mg）；磷酸二氫銨為分析純；水為超純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：JADE-PAK ODS-AQ（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.008 mol/L磷酸二氫銨溶液（pH＝3.6），流速：0.5 ml/min；紫外檢測器，檢測波長：194 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液。精密稱取在105 ℃干燥4 h的硫酸軟骨素鈉對照品約25 mg，置于25 ml 量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻；精密量取5 ml，置于200 ml 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液。取樣品20 片，精密稱定，研細，精密稱取適量（約相當于硫酸軟骨素鈉25 mg），置于50 ml量瓶中，加乙腈5 ml，加水25 ml，超聲（功率：250 W，頻率：45 kHz）約10 min使硫酸軟骨素鈉溶解，加水稀釋至刻度，搖勻，濾過；精密量取續濾液10 ml，置于200 ml量瓶中，加水稀釋至刻度，作為供試品溶液。

2.2.3 陰性樣品溶液。按樣品處方比例，制備除硫酸軟骨素鈉外的陰性樣品，并按“2.2.2”項下方法制備陰性樣品溶液。

2.3 系統適用性試驗

取供試品（批號：20130620）溶液注入色譜儀，記錄色譜圖，以硫酸軟骨素鈉峰計理論板數為11 369，硫酸軟骨素鈉峰與相鄰峰的分離度為2.01，見圖1。

2.4 專屬性試驗

分別吸取供試品溶液、對照品溶液和陰性樣品溶液，注入色譜儀。結果，陰性樣品溶液在與對照品相應的保留時間處，無色譜峰出現，表明處方中各成分及輔料不干擾硫酸軟骨素鈉的含量測定，見圖1。

圖1 系統適用性試驗高效液相色譜圖A.供試品溶液；B.對照品溶液；C.陰性樣品溶液；1.硫酸軟骨素Fig 1 HPLC chromatograms of system suitability testA.sample solution；B.reference solution；C.negative solution；1.chondroitin sulfate

2.5 破壞性試驗

分別取樣品細粉（批號：20130620）適量（約相當于硫酸軟骨素鈉25 mg），置于50 ml量瓶中，其中3份分別加入0.1 mol/L鹽酸溶液5 ml、0.1 mol/L 氫氧化鈉溶液5 ml 和30%雙氧水2 ml，放置30 min后中和，加乙腈5 ml、水25 ml，超聲（功率：250 W，頻率：45 kHz）約10 min，加水稀釋至刻度，搖勻；另外2 份分別置于3 000 lx光線下放置6 h和100 ℃加熱12 h后，加乙腈5 ml、水25 ml，超聲約10 min，加水稀釋至刻度，搖勻。取上述溶液注入色譜儀。結果顯示，硫酸軟骨素鈉對酸、堿和光照均較穩定，雜質未見明顯變化，加熱條件下發生降解，但在氧化條件下更易降解；各破壞條件下的降解產物峰對硫酸軟骨素鈉峰均無干擾，分離效果良好，見圖2。

2.6 定量限和檢測限試驗

取對照品溶液，以不同比例稀釋，在上述色譜條件下測定。以信噪比為10∶1確定定量限為0.75 μg/ml，即7.5 ng；以信噪比為3∶1確定檢測限為0.25 μg/ml，即2.5 ng。

2.7 線性關系考察

精密稱取硫酸軟骨素鈉對照品約62.5 mg，置于50 ml 量瓶中，加水振搖使溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為對照品貯備液。分別精密量取對照品貯備液1、1.5、1、2、3、1、5 ml，置于250、250、100、100、100、25、100 ml 量瓶中，用水稀釋至刻度，制備成5、7.5、12.5、25、37.5、50、62.5 μg/ml 的硫酸軟骨素鈉對照品系列溶液，按上述色譜條件進樣測定，記錄色譜圖，以峰面積（A）為縱坐標、對照品質量濃度（c）為橫坐標，繪制標準曲線，得線性方程A＝19 166.284 6c+4.589 3（r＝0.999 9）。結果表明，硫酸軟骨素鈉檢測質量濃度線性范圍為5～62.5 μg/ml。

2.8 精密度試驗

取“2.12”項下對照品溶液，連續進樣6 次，其峰面積RSD為0.1%（n＝6）。

2.9 重復性試驗

取同一批號的樣品，按“2.2.2”項下方法處理制備、進樣，平行測定6 次，平均含量為19.66 mg，RSD 為0.3%（n＝6）。

2.10 回收率試驗

取已知含量的樣品（批號：20130620，每片含19.52 mg），加入硫酸軟骨素鈉對照品分別制備成相當于標示量80%、100%、120%含量的樣品，各3個共9份樣品，按含量測定方法測定含量，結果平均回收率為99.1%，RSD＝0.7%。結果見表1。

圖2 破壞性試驗高效液相色譜圖A.酸破壞后樣品；B.堿破壞后樣品；C.光照破壞后樣品；D.熱破壞后樣品；E.氧化破壞后樣品；1.硫酸軟骨素Fig 2 HPLC chromatograms of destruction testA.sample destructed by acid；B.sample destructed by alkali；C.sample destructed by light；D.sample destructed by high temperature；E.sample destructed by oxidation；1.chondroitin sulfate

表1 回收率試驗（n＝3）Tab 1 Results of recovery tests（n＝3）

2.11 穩定性試驗

取同一份供試品（批號：20130620）溶液，在室溫下放置0、2、4、6、8、12 h后測定，結果硫酸軟骨素鈉的峰面積的RSD＝0.6%（n＝6）。結果表明，供試品溶液在12 h內穩定。

2.12 樣品含量測定

按“2.2.1”“2.2.2”項下方法制備供試品溶液和對照品溶液，按“2.1”項下的色譜條件測定，外標法計算含量，分別對3批樣品進行含量測定，結果見表2。

表2 樣品含量測定結果Tab 2 Results of content determination of samples

3 討論

3.1 檢測波長的選擇

取對照品溶液，于190～400 nm 波長范圍內掃描繪制其紫外吸收光譜，結果，硫酸軟骨素鈉在194 nm 波長處有最大吸收，故本次試驗選其為檢測波長。

3.2 色譜條件的選擇

3.2.1 流動相的選擇。分別試用辛烷對氨基苯磺酸鈉溶液、庚烷磺酸鈉溶液[4-5]和磷酸二氫銨溶液作為流動相，結果發現峰形均好，出峰時間分別為5.957、4.854、7.546 min，與相鄰峰的分離度分別為1.36、1.24、2.01，但前2 種溶液為流動相時出峰太快，且分離效果不太好，因此最終采用磷酸二氫銨溶液。因一般情況下加入乙腈能增加洗脫能力，使峰形更好，故筆者嘗試加入一定比例的乙腈[4-5]：0.008 mol/L磷酸二氫銨溶液-乙腈（97 ∶3）、0.008 mol/L 磷酸二氫銨溶液-乙腈（95 ∶5）、0.008 mol/L磷酸二氫銨溶液-乙腈（90 ∶10），結果并未見柱效提高和分離效果更好，同時出峰時間卻加快了不少，故未加入乙腈。也嘗試過選用不同離子強度的磷酸二氫銨溶液（0.008、0.010、0.015 mol/L），結果發現不同離子強度下柱效和分離效果未見明顯變化，因此選用0.008 mol/L 的離子強度。色譜柱選用了水性柱，其不但能夠支持100%的無機相，且不會損害色譜柱。

3.2.2 溶劑的選擇。樣品為復方制劑，其中吡拉西坦、維生素B1、維生素B6、硫酸軟骨素鈉溶于水，谷氨酸微溶于水，腦蛋白水解物為蛋白質類。當以水作溶劑時，在硫酸軟骨素峰附近出現有較大的峰，與硫酸軟骨素峰層疊在一起分不開；當加入5 ml 乙腈作為提取溶劑時，因減少了其他水溶性物質的溶解度，結果表明能較好地分開硫酸軟骨素峰與相鄰峰。因此采用25 ml水中加入5 ml乙腈為提取溶劑。

復方吡拉西坦腦蛋白水解物片是復方制劑，成分比較多，若參照文獻進行酶解[3]，硫酸軟骨素可酶解成硫酸軟骨素A、B、C，而硫酸軟骨素A、B、C 與相鄰峰難以分開。本試驗則不進行酶解試驗，故直接測定的成分是硫酸軟骨素鈉，操作較為簡單，故可作為測定硫酸軟骨素鈉含量的方法依據。

[1]白求恩醫科大學制藥廠二分廠.復方吡拉西坦腦蛋白水解物片說明書[S].2010.

[2]國家藥典委員會.國家藥品標準：化學藥品地方標準上升國家標準：第十六冊[S].2003：317-318.

[3]任麗萍，于海洲，宋玉娟，等.酶解液相色譜法測定硫酸軟骨素鈉含量[J].藥物分析雜志，2012，32（7）：1 246.

[4]狄平平，勞苑子，趙立平，等.HPLC 法測定復方氨基葡萄糖片中鹽酸氨基葡萄糖和硫酸軟骨素含量[J].中國藥事，2010，24（3）：283.

[5]石瑞平，胡海勛.離子對反相高效液相色譜法測定硫酸軟骨素滴眼液的含量及有關物質[J].藥物分析雜志，2008，28（9）：1 574.

[6]金鵬飛，吳學軍，鄒定.HPLC-DAD 同時測定復方尿維氨滴眼液中3 種活性成分的含量[J].中國藥學雜志，2009，44（21）：1 669.

[7]牛增元，袁玲玲，葉曦雯.高效液相色譜法同時測定硫酸軟骨素和鹽酸氨基葡萄糖的含量[J].藥物分析雜志，2006，26（6）：802.

[8]曾芬.RP-HPLC 法測定鯊芪康膠囊中硫酸軟骨素含量[J].海峽藥學，2010，22（7）：88.