促進骨髓間充質干細胞增殖方法的研究進展

于海生，王 寧（1.重鋼總醫院超聲科，重慶 400084；2.重慶市腫瘤醫院超聲科，重慶 400030）

間充質干細胞屬于中胚層的一類多能干細胞，主要存在于結締組織和器官間質中，以骨髓組織中含量最為豐富，因此統稱骨髓間充質干細胞（Bone mesenchymal stem cells，BMSCs）。BMSCs具有來源方便且易于分離、培養、擴增和純化等特點，多次傳代擴增后仍具有干細胞特性，在一定的誘導條件下可分化為成骨細胞、軟骨細胞、肌肉細胞、神經細胞和脂肪細胞等多種組織細胞，且免疫原性弱。因此，BMSCs作為組織工程學中的理想種子細胞受到了越來越多學者的重視[1-4]。

研究表明，生產組織工程化產品要獲得臨床的廣泛應用，需要大量的種子細胞[5]。盡管骨髓中BMSCs 的含量相對較多，但在正常狀態下生長緩慢，而且隨著年齡增加BMSCs的數量將逐漸減少。因此，要想獲得數量多、活性高、分化功能良好的種子細胞以滿足組織工程學應用要求，就必須對BMSCs進行擴增。因此，如何通過有效的技術手段來獲得大規模、具有再生活力的種子細胞，成為了當前組織工程研究亟需解決的關鍵問題。本文以“骨髓間充質干細胞”“種子細胞”“組織工藝學”“細胞增殖”等的中、英文詞匯為關鍵詞，組合檢索2000－2013年中國知網、萬方數據庫、PubMed等中的文獻，結果共查詢到文獻106篇，其中有效文獻27篇，現對有關促進骨髓間充質干細胞增殖的方法進行綜述。

1 中藥對BMSCs增殖的影響

目前，中藥促進BMSCs的增殖研究取得了很大進展。中藥具有滋陰補陽、強身壯體、增智健腦、抗衰老和調節免疫功能、毒副作用小、療效好等特點，被廣泛應用于誘導BMSCs增殖研究中，并已形成產品應用于臨床中以促進BMSCs增殖，如將中藥用于治療骨質疏松和骨折修復等。中藥主要通過調動或調整機體細胞內在機制以促進BMSCs 增殖。Chen DF 等[6]研究發現，龜板提取物能夠促進BMSCs增殖，細胞增殖活性明顯活躍。同時，篩選龜板提取物有效濃度范圍為0.01～3.0 mg/ml，經細胞周期分析表明，龜板提取物能增加處于S期（增殖期）BMSCs 的比例，并證明了龜板提取物的主要化學成分（主要含有脂肪酸、類固醇及氨基酸等）和藥理活性的機制。劉國巖等[7]利用不同質量濃度骨碎補（0.2、2、20 mg/ml）促進BMSCs 增殖，研究表明增殖活性因子之一堿性成纖維細胞生長因子（bFGF）表達增加，成骨能力明顯增強，從而加速了BMSCs 增殖，其中以質量濃度2 mg/ml 促進作用最為明顯。黃進等[8]利用黃芪多糖體外促進BMSCs增殖，1、2、3 mg/ml黃芪多糖組均具有促進BMSCs增殖，MTT檢測細胞吸光值（0.499 8±0.005）、（0.496 3±0.005）、（0.472 5±0.005）明顯高于空白對照組（0.360 8±0.005），其中以1 mg/ml 促進作用最為明顯（P＜0.01）。

雖然中藥促進BMSCs的增殖取得了很大進展，但是中藥促進BMSCs增殖尚存在以下問題：中藥強調的是多靶點體系與分子之間的協同作用，而且中藥組織成分復雜，多為復方用藥，其有效化學成分難以明確，不能高效利用；再者，中藥與BMSCs 的量效關系、藥理作用及其作用機制尚不十分清楚。因此，今后應加強對此類中藥進行有效分子水平活性成分提取，以確定中藥的有效成分，并對其作用機制進行深人研究，從細胞水平、分子水平或基因水平方面揭示中藥促進BMSCs增殖的機制具有重要意義。

2 電磁場對BMSCs增殖的影響

研究表明，脈沖電磁場（Pulsed electromagnetic fields，PEMFs）可促進骨組織的愈合和重建，具有促進種子細胞增殖及轉化、刺激骨局部生長因子分泌、合成細胞外基質（Extracellular matrix，ECM）和加速骨的發育等多種作用。目前，臨床上利用電磁場設備進行骨折延遲愈合、骨不連結、骨質疏松等治療，具有效果顯著、操作簡便、費用低廉等特點[9-11]。

電磁場頻率在1～100 Hz 范圍時會對組織和細胞產生生物學效應，而人體骨骼系統的內生性活動頻率范圍在步態頻率（1～5 Hz）到肌肉收縮的動力頻率（10～100 Hz）間變化。Lee JH等[12]認為，最有效的電磁場頻率范圍應該與機體正常功能活動頻率相接近，才能使電磁場發揮最大的刺激功效作用。Liu C等[13]利用電磁場強度1 mT，頻率為10、30、50、70 Hz刺激體外培養的第3代BMSCs，刺激時間2 h，發現電磁場頻率10 Hz 時能夠大幅提升BMSCs 增殖標志物堿性磷酸酶（ALP）和骨鈣素的表達，BMSCs增殖活性明顯增強。然而，電磁場頻率在50、70 Hz時，BMSCs細胞增殖活性反而下降。

目前，PEMFs 作用于BMSCs 的增殖機制還不夠明確，雖然已形成產品并應用于臨床，但是僅在小范圍內應用，如何獲得更大規模、安全高效的應用，還有待進一步研究。

3 ECM對BMSCs增殖的影響

ECM由大分子構成，其構成錯綜復雜，能為細胞的生長及活動提供適宜的場所。研究表明，ECM 可通過自身所帶電荷先吸附到培養儀器表面，然后BMSCs 再與ECM 結合，從而加速BMSCs黏附和貼壁，細胞與基質這種黏附對于調節細胞生長和增殖行為十分重要[14]。

Jager M 等[15]將BMSCs 分別接種到D，D，L，L-聚交酯（PLLA）、Ⅰ/Ⅲ型膠原以及聚乳素-910/聚二氧環己酮（PGPD）3種支架上。結果發現，4 h 后鏡下觀察Ⅰ/Ⅲ型膠原上BMSCs的貼壁數量明顯多于其他兩個支架細胞（膠原＞PLLA＞PCPD）。ECM促進BMSCs增殖的機制目前還不完全清楚，但Larsen M[16]等推測其促進增殖的機制可能與化學信號通過整合素-黏著斑（Focal adhesion plaques，FAP）激酶-胞外信號調節激酶（Extracellular signal-regulated kinase，ERK）途徑傳遞有關。整合素的胞外區與ECM相連，胞內區與細胞骨架相接，形成FAP，由此將ECM 產生的化學信號傳遞到細胞內，調節BMSCs 的生長、增殖、遷移等過程。但是，ECM 這種促進BMSCs增殖的機制還有待證實，相應的技術路線仍需進一步完善。

4 機械刺激對BMSCs增殖的影響

機械刺激對BMSCs的體外增殖也有重要的調節作用。機體細胞和組織器官處于一種復雜的力學微環境中，BMSCs 的增殖和分化高度依賴其所處的微環境[17-18]。Song G 等[19]研究發現，不同機械刺激的大小、作用方式及作用時間對BMSCs增殖分化的調節作用不盡相同。當機械刺激頻率為1 Hz、形變量為5%并分別拉伸15、30、60 min 時，機械刺激能顯著促進BMSCs增殖；當形變量增加至10%、拉伸60 min時，細胞增殖會受到抑制；繼續增加形變量至15%、拉伸15 min時則會抑制BMSCs 增殖；將拉伸時間延長至30、60 min 時卻會再次促進BMSCs 增殖；然而長時間的機械拉伸（12 h 或24 h）對BMSCs增殖將起到抑制作用。經李曉娜等[20]證實，機械拉伸刺激能影響大鼠BMSCs的遷移行為，基質金屬蛋白酶2（Metalloproteinases，MMP-2）、MMP-9在此過程中可能起著重要的介導作用，但具體機制目前還不夠明確。

適當的機械力學刺激可促進體外細胞的增殖和功能的維持，但過度或持續時間過長的機械刺激又會對細胞的結構和功能造成損害[21]。目前，這種機械力作用的大小及作用機制還有待進一步研究。

5 生長因子對BMSCs增殖的影響

細胞因子是組織工程中的重要因素，其通過細胞間的信號傳遞來影響細胞活動，具有促進或抑制細胞分裂、增殖、遷移和基因表達等作用。生長因子的合理應用對組織工程起著關鍵作用，目前在骨組織中發現了十幾種生長因子。其中，bFGF、轉化生長因子（TGF）、胰島素樣生長因子（IGF）、血小板衍生生長因子（PDGF）和表皮生長因子（EGF）等多種細胞因子對BMSCs具有重要的調節作用，可促進細胞增殖和膠原合成、加速血管生長及在骨吸收改建方面發揮作用。因此，在組織工程對細胞因子合理使用或調控BMSCs的適時適量表達十分重要。研究表明，bFGF 是目前已知最強的促細胞生長因子[22]。Yuan S等[23]研究發現，骨形態發生蛋白-4/7（Bone morphogenetic protein，BMP-4/7）能顯著促進骨髓基質細胞的增殖（P＜0.05）；同時，也能促進BMSCs 的成骨分化。BMP-4/7 和bFGF在促進細胞增殖時具有顯著的協同作用。

隨著分子生物學、生物化學不斷深入研究，各種生長因子在組織工程中的作用日益受到重視。但其使用過程中還存在諸多問題：（1）生長因子與細胞增殖之間的量效關系、相互作用、協同或拮抗作用及其作用機制都不十分明確，因此細胞增殖是一個極其復雜的過程。經李斌等[24]證實，TGF-β1 分別與bFGF、IGF-I 在誘導BMSCs 形成軟骨細胞的過程中具有協同作用。但各種生長因子之間的相互作用機制及量效關系目前尚不明確，需要長期的探究。（2）生長因子的生物活性難以控制，極易使種子細胞發生定向分化而變性，造成細胞基因突變，從而導致危險。（3）生產生長因子的費用較高。

6 轉基因技術對BMSCs增殖的影響

轉基因（Gene transfer）是指將外源目的基因通過載體轉移到靶細胞內，以補償靶細胞的基因缺陷。其主要作用是調節靶細胞蛋白質分泌水平，使靶細胞獲得新的生物學行為和功能。利用轉基因方法促進種子細胞增殖是當今組織工程研究中的又一熱點。蔣柳宏等[25]利用脂質體轉染法，將真核重組表達質粒（bFGF-pcDNA3）轉染至體外培養的BMSCs，篩選出穩定表達bFGF的BMSCs細胞株，并發現自身表達的bFGF可促進BMSCs 增殖。Lin WP 等[26]利用轉基因技術將生長因子Neuroglobin 植入實驗兔的BMSCs，結果發現兔的損傷組織重塑和纖維束生長顯著增快。目前，利用轉基因技術已將人端粒逆轉錄酶（hTERT）基因成功轉入中國貴州小豬的BMSCs內，發現轉染后的BMSCs與正常培養的BMSCs具有相同的增殖活性，同時轉染后的BMSCs壽命得到延長[27]。但是，這項技術也面臨一些難題需要解決，如基因轉染效率低、體內表達時間短、是否會導致惡變及轉基因后能否保持原來的生物學特性等。目前，轉基因技術還處于初步研究階段，技術條件的不完善決定了其在短時間內難以全面推廣應用。

7 結語

BMSCs 作為組織工程學中的理想種子細胞，近年來受到學者們的廣泛關注，已成為醫學領域乃至整個生命科學領域的研究熱點，如中藥、電磁場擴增種子細胞都已形成產品應用于臨床。對種子細胞的大量擴增是其要解決的關鍵問題。上述幾種促進BMSCs增殖的方法，雖然在種子細胞的擴增方面起到了一定作用，但是每種方法都存在或多或少的缺陷，需要更加深入地進行探究。當前，利用上述方法對種子細胞進行大量擴增仍存在一定的局限性，還無法在短期內推廣應用。展望未來，尋找一種更為簡便、經濟、安全、有效的擴增種子細胞的方法顯得尤為重要。

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