替尼泊苷注射液細菌內毒素檢查方法的建立

李 潔，陳娟紅，邵麗曉（武警浙江省總隊醫院，浙江嘉興 314000）

替尼泊苷注射液為抗腫瘤藥物，為周期特異性細胞毒類藥物，通過抑制拓撲異構酶Ⅱ，阻止細胞進入有絲分裂期[1]。體外試驗發現替尼泊苷對人胃腺癌BGC-823細胞具有良好的抑制生長作用，主要用于惡性淋巴瘤、中樞神經系統腫瘤和膀胱癌的治療[2]。《中國藥典》對注射劑的細菌內毒素限值作了明確的規定，傳統的熱原檢查法成本高、操作復雜、影響因素多、重現性差，而細菌內毒素檢查法則操作簡便、重現性好、成本低，已被廣泛應用，但目前未見替尼泊苷注射液細菌內毒素檢查法的文獻報道。本文通過試驗探討，建立用細菌內毒素凝膠檢查法檢查替尼泊苷注射液中細菌內毒素的可行性。

1 材料

1.1 儀器

BET-32細菌內毒素測定儀（天大天發科技有限公司）；ZH-2自動漩渦混合器（天津藥典標準儀器廠）；BS-1300U型超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）；SC-101型鼓風電熱恒溫干燥箱（浙江嘉興新塍電器設備有限公司）。

1.2 藥品與試劑

替尼泊苷注射液（百時美施貴寶公司，批號：1M00553、2B01212、3C01331，規格均為：1 ml ∶10 mg，pH 6.5）；鱟試劑[湛江安度斯生物有限公司，批號：1108201，標示靈敏度（λ）：0.25 EU/ml；福州新北生化工業有限公司，批號：1203071，λ：0.125 EU/ml；規格：每支均為0.1 ml）；細菌內毒素工作標準品（CSE，批號：1010150，規格：每支10 EU）、細菌內毒素檢查用水（BET水，批號：1008123，規格：每支5 ml）均為湛江安度斯生物有限公司產品。

2 方法與結果

2.1 鱟試劑靈敏度復核試驗

根據2批鱟試劑靈敏度的標示值，將CSE用BET水溶解，置于漩渦混合器混合15 min，然后制成濃度為2λ、1λ、0.5λ、0.125λ（0.50、0.25、0.125、0.062 5 EU/ml或0.25、0.125、0.062 5、0.031 25 EU/ml）4個濃度的細菌內毒素標準溶液，按2010年版《中國藥典》附錄細菌內毒素檢查法復核試驗用鱟試劑的靈敏度[3]，計算反應終點濃度的幾何平均值，即鱟試劑靈敏度的測定值（λc）。λc＝antilg（∑X/4），X為反應終點濃度的對數值，而反應終點濃度是指系列遞減的內毒素濃度中的最后一個呈陽性結果的濃度。結果2批鱟試劑λc均在0.5λ～2.0λ范圍內，均符合《中國藥典》規定，可用于細菌內毒素檢查，詳見表1。

表1 鱟試劑靈敏度復核結果Tab 1 Recheck results of TAL sensitivity test

2.2 樣品細菌內毒素限值（L）的確定

按2010年版《中國藥典》細菌內毒索檢查法的規定：L＝K/M，L為供試品細菌內毒素的限值。K為按規定的給藥途徑給藥人每千克體質量每小時最大可接受的內毒素劑量，注射劑K＝5 EU/（kg·h）。M為人用每千克體質量每小時的最大供試品劑量，從替尼泊苷注射液的使用說明書可知本品的最大日推薦劑量是130 mg/m2[4]，推薦劑量以上則可能導致不良反應的增加，供試品每平方米體表面積劑量乘以0.027即可轉換為每千克體質量的劑量。每天1次，人均表面積按1.62 m2計算，靜注時間按1 h計算[3]，由于本品為皮下注射或靜脈內給藥，則K＝5 EU/（kg·h），M＝1.62×130×0.027/60（kg·h）＝0.094 77 mg/（kg·h），L＝K/M＝5/0.094 77＝53 EU/mg。根據2010年版《中國藥典》附錄“化學藥品注射劑安全性檢查法應用指導原則”的要求，限值可適當嚴格，至計算值的1/3～1/2，以保證安全，本試驗安全系數定為3[3]，故L＝53/3＝18 EU/mg。

2.3 供試品最小有效稀釋質量濃度（c）的確定

按2010年版《中國藥典》細菌內毒索檢查法的規定，最大有效稀釋倍數（MVD）＝cL/λ。目前市售鱟試劑靈敏度最高為λ＝0.03 EU/ml，替尼泊苷注射液的規格均為1 ml ∶10 mg，計算得MVD＝cL/λ＝10×18/0.03＝6 000，由此可知，供試品稀釋倍數應不大于6 000倍，即最小有效稀釋質量濃度c1≥0.001 7 mg/ml，由此進行干擾試驗，以確定最大不干擾濃度。

2.4 預干擾試驗[5]

取3批次替尼泊苷注射液各1瓶，用BET水稀釋至125倍，而后用BET水倍比稀釋至125、250、500、1 000、2 000、4 000倍，連同原液制成10、0.08、0.04、0.02、0.01、0.005、0.002 5 mg/ml共7個濃度梯度溶液，將此系列濃度溶液標記為供試品管（NPC系列，各2管）；用上述稀釋液作為溶劑，分別溶解并稀釋CSE，制得每個稀釋度中細菌內毒素含量均為2.0λ（0.5或0.25 EU/ml）的替尼泊苷液，標記此系列溶液為陽性對照管（PPC系列，各2管）。同時做細菌內毒素陽性對照管（PC）及BET水陰性對照管（NC）各2管，然后按細菌內毒素檢查法操作，進行預干擾試驗，結果見表2、表3。

表2 樣品預干擾試驗結果（λ＝0.25 EU/ml）Tab 2 Results of preliminary interference test of sample（λ＝0.25 EU/ml）

表3 樣品預干擾試驗結果（λ＝0.125 EU/ml）Tab 3 Results of preliminary interference test of sample（λ＝0.125 EU/ml）

由表2結果可知，3批樣品稀釋至0.02 mg/ml或以下質量濃度的溶液時，對λ為0.25 EU/ml的鱟試劑與細菌內毒素的反應無干擾作用。

由表3結果可知，3批樣品稀釋至0.01 mg/ml或以下質量濃度的溶液時，對λ為0.125 EU/ml的鱟試劑與細菌內毒素的反應無干擾作用。

2.5 干擾試驗[6]

根據預干擾試驗結果，取3個批號的替尼泊苷注射液，對應相應的鱟試劑靈敏度，用BET水稀釋成0.02 mg/ml（500倍）、0.01 mg/ml（1 000倍）質量濃度的樣品稀釋溶液，并用此樣品稀釋溶液將CSE分別稀釋成2λ、1λ、0.5λ、0.25λ系列濃度，按2010年版《中國藥典》二部附錄的細菌內毒素檢查法進行干擾試驗。通過試驗結果計算Es和Et，計算公式分別為Es＝antilg（∑Xs/4）和Et＝antilg（∑Xt/4）[Xs系用BET水制成的細菌內毒素標準溶液反應終點濃度的對數值（lg），Xt系用供試品溶液制成的內毒素標準溶液反應終點濃度的對數值（lg），Es系用BET水制成的細菌內毒素標準溶液反應終點濃度的幾何平均值；Et系用供試品溶液制成的內毒素標準溶液反應終點濃度的幾何平均值]，結果見表4。

表4 樣品干擾試驗結果Tab 4 Results of interference test of sample

由表4結果顯示，2種不同靈敏度的鱟試劑Es在2λ～0.5λ之間，且Et在2Es～0.5Es之間，表明替尼泊苷注射液稀釋液≤0.02 mg/ml對λ為0.25 EU/ml的鱟試劑試驗無干擾，替尼泊苷注射液稀釋液≤0.01 mg/ml對λ為0.125 EU/ml的鱟試劑試驗無干擾，可用于細菌內毒素檢查。

2.6 樣品細菌內毒素檢查

試驗中采用的2種不同靈敏度的鱟試劑（λ1＝0.25 EU/ml；λ2＝0.125 EU/ml），相對應的MVD1＝cL/λ＝10×18/0.25＝720，MVD2＝cL/λ＝10×18/0.125＝1 440，而干擾試驗的結果分別為500、1 000倍，小于對應的MVD1、MVD2，符合《中國藥典》細菌內毒素檢查要求，因而可進行內毒素檢查。取3個批號的供試品，對應于λ＝0.25 EU/ml鱟試劑，用BET水500倍稀釋（c＝0.02 mg/ml）；對應于λ＝0.125 EU/ml鱟試劑，用BET水1 000倍稀釋（c＝0.01 mg/ml）；按文獻[4]細菌內毒素檢查法，并按要求對應相應的鱟試劑，平行做陽性（PPC、PC）、陰性（NPC、NC）對照，結果見表5。

表5 樣品細菌內毒素檢查結果Tab 5 Results of bacterial endotoxin test of sample

由表5結果可知，NPC和NC陰性對照管均為陰性，表明樣品中未檢出細菌內毒素；PPC和PC陽性對照管均為陽性，表明試驗有效。試驗表明，用2種靈敏度的鱟試劑，對3個批次替尼泊苷注射液的細菌內毒素檢查結果均符合規定。

3 討論

預干擾試驗目的是評價樣品質量濃度對鱟試劑與內毒素凝集反應的干擾程度，初步篩出對細菌內毒素檢查無干擾的樣品濃度范圍。而干擾試驗的目的則是對預干擾試驗初步篩出無干擾的樣品質量濃度的進一步確認。另外，不同廠家的鱟試劑由于生產工藝、質量參數等方面有一定差異，其抗干擾能力存在差異[7-8]。由于替尼泊苷結構較復雜，較高質量濃度時對內毒素試驗的凝集有一定的干擾，但通過BET水的稀釋則完全可以排除干擾。本試驗采用2個不同廠家的鱟試劑（λ1＝0.25 EU/ml、λ2＝0.125 EU/ml）對3個批號的樣品進行試驗，對應將樣品稀釋至質量濃度≤0.02 mg/ml、≤0.01 mg/ml時，不干擾細菌內毒素檢查。因此，替尼泊苷注射液用凝膠法進行細菌內毒素檢查是可行的。

[1]高明，趙丹.沙利度胺聯合替尼泊苷對人胃腺癌移植瘤生長的影響[J].中國醫藥指南，2013，11（23）：58.

[2]Wang M，Ming G，Wei H，et al.Oxaliplatin and teniposide can inhibit the proliferation and induce the apoptosis of gastric cancer cell line BGC-823 syrergisticall[J].Chinese-German Journal of Clinical Oncology，2010，3（9）：149.

[3]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：二部[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄ⅪE、ⅪⅩ.

[4]百時美施貴寶公司.替尼泊苷注射液說明書[S].2011-02-10.

[5]曾云勝.復方甘草酸苷注射液的細菌內毒素檢查[J].中國醫院藥學雜志，2013，33（17）：1 456.

[6]黃榮富，厲青，李龍健，等.注射用尖吻蝮蛇血凝酶細菌內毒素檢查方法的建立[J].中國藥房，2013，24（17）：1 602.

[7]周梅，武谷.注射用鹽酸吉西他濱細菌內毒素檢查方法的研究[J].中國藥房，2013，24（1）：76.

[8]楊娟，李昇剛，朱愛民.環磷腺苷注射液的細菌內毒素檢查方法探討[J].中國藥師，2013，16（1）：145.