HPLC法同時測定甘草中18α-甘草酸和18β-甘草酸的含量Δ

陳 瑩，趙 博，喬 佳，張 慧（遼寧中醫藥大學藥學院，遼寧大連 116600）

甘草酸是從豆科植物甘草中提取的一種三萜皂苷，是甘草中最重要的有效成分之一[1]。甘草酸具有兩種構型，分別是18α-甘草酸（甘草酸二銨）和18β-甘草酸（甘草酸單銨），二者互為反向異構體，在甘草中同時存在。18α-甘草酸和18β-甘草酸均具有抗炎、保肝、抗纖維化、抗腫瘤等藥理作用[2-4]，由二者制成的片劑、注射劑在臨床上廣泛應用[5-6]。目前多見采用高效液相色譜（HPLC）法測定甘草中18β-甘草酸含量的報道[7-9]，尚未見測定甘草中18α-甘草酸含量及方法的報道。為了更好地掌控甘草藥材的質量，筆者采用HPLC法在同一色譜條件下同時測定甘草中18α-甘草酸和18β-甘草酸的含量，試驗結果可為不同商品規格甘草藥材的質量評價提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-10A型HPLC系統，包含紫外檢測器、LC solution 色譜工作站等（日本島津公司）；CP225D型電子分析天平（德國Sartorius 公司）；KQ5200DB 型數控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 試劑

18α-甘草酸、18β-甘草酸對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：101050-201101、110731-201116，含量均≥98.0%）；乙腈為色譜純，其余試劑均為分析純，水為哇哈哈純凈水。

1.3 藥材

市售10 個不同商品規格的甘草藥材，均經遼寧中醫藥大學中藥鑒定教研室翟延君教授鑒定為豆科植物甘草（Glycyrrhiza uralensis Fisch.）、脹果甘草（Glycyrrhiza inflata Bat.）或光果甘草（Glycyrrhiza glabra L.）的干燥根和根莖，詳見表1。

表1 不同商品規格樣品的商家和來源Tab 1 Manufacturers and sources of samples with different specifications

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Ecosil-C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-0.1%磷酸鹽緩沖液（80 ∶20，V/V，pH 7）；流速：1.0 ml/min；檢測波長：250 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 分別精密稱取18α-甘草酸、18β-甘草酸對照品各適量，置于同一25 ml 量瓶中，加70%乙醇溶解并定容，制成18α-甘草酸、18β-甘草酸的質量濃度均為0.2 mg/ml的混合溶液，作為對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取甘草藥材粉末（過三號篩）約0.2 g，精密稱定，置于具塞錐形瓶中，精密加入70%乙醇100 ml，密塞，稱定質量，超聲處理（功率：250 W，頻率：40 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用70%乙醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.3 系統適用性試驗

在“2.1”項色譜條件下，分別取“2.2”項下對照品溶液和供試品溶液10 μl，注入HPLC儀，記錄色譜，詳見圖1。系統適用性試驗結果表明，理論板數以18β-甘草酸峰計算為4 400，分離度＞1.5。

圖1 高效液相色譜圖A.對照品；B.供試品；1.18β-甘草酸；2.18α-甘草酸Fig 1 HPLC chromatogramsA.substance control；B.test samples；1.18β-glycyrrhizic acid；2.18αglycyrrhizic acid

2.4 線性關系考察

精密稱取18α-甘草酸對照品10.14 mg、18β-甘草酸對照品10.28 mg，分別置于同一10 ml量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，作為貯備液。精密量取上述貯備液0.03、0.5、1.0、1.5、3.0 ml，分別置于10 ml 量瓶中，用流動相溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成系列溶液，分別取10 μl 注入HPLC 儀，記錄色譜。以質量濃度（x，μg/ml）為橫坐標，峰面積（y）為縱坐標，進行線性回歸，得18α-甘草酸和18β-甘草酸回歸方程y＝4×106x+6 876.1（r＝0.999 9）、y＝4×106x+2 650.4（r＝0.999 9）。結果表明，18α-甘草酸、18β-甘草酸檢測質量濃度分別在3.042～304.2、3.084～308.4 μg/ml范圍內與各自峰面積積分值呈良好的線性關系。

2.5 精密度試驗

精密吸取“2.2.1”項下對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件重復進樣6次，記錄各色譜峰面積。結果，18α-甘草酸、18β-甘草酸的RSD分別為0.86%、0.92%，表明儀器的精密度良好。

2.6 穩定性試驗

取同一商品規格甘草藥材粉末（沈陽成大方圓藥店）適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，放置0、2、4、6、8 h時按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄各色譜峰面積。結果，18α-甘草酸、18β-甘草酸的RSD分別為0.63%、0.82%，表明供試品溶液在8 h內質量穩定。

2.7 重復性試驗

取同一商品規格甘草藥材粉末（沈陽成大方圓藥店）適量，分別按“2.2.2”項下方法平行制備6 份供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件進樣，記錄各色譜峰面積，計算含量。結果，含18α-甘草酸、18β-甘草酸的量分別為0.91%、4.38%，RSD分別為0.75%、1.02%，表明本方法的重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取0.1 g 已知含量的甘草藥材粉末（沈陽成大方圓藥店），共6 份，分別精密加入18α-甘草酸、18β-甘草酸對照品溶液適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算加樣回收率，結果見表2。

表2 加樣回收率試驗結果（n＝6）Tab 2 Results of recovery test（n＝6）

2.9 樣品含量測定

取10 個商品規格甘草藥材粉末各3 份，精密稱定，按照“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，并按“2.1”項下色譜條件進樣測定峰面積，按外標法計算含量，結果見表3。

表3 樣品含量測定結果（%，，n＝3）Tab 3 Results of content determination of samples（%，，n＝3）

表3 樣品含量測定結果（%，，n＝3）Tab 3 Results of content determination of samples（%，，n＝3）

-：表示未檢出-：means no detected

3 討論

3.1 檢測波長的確定

精密稱取18α-甘草酸、18β-甘草酸對照品適量，加流動相溶解，分別制成每1 ml約含30 μg的溶液，在200～400 nm波長范圍掃描。結果顯示，二者均在（250±2）nm波長處有最大吸收，因此選擇250 nm作為含量測定的檢測波長。

3.2 流動相的確定

筆者曾采用0.05%磷酸溶液-乙腈梯度洗脫的方法[10]，結果所需洗脫時間較長；還曾采用甲醇-0.2 mol/L醋酸銨-冰醋酸為流動相[7-8]，結果主峰未與雜質峰分離。最終，確定本試驗的流動相為乙腈-0.1%磷酸鹽緩沖液（80 ∶20，V/V，pH 7）。在此條件下洗脫時間短，且主峰與雜質峰分離度良好。

3.3 樣品提取方法的確定

根據18α-甘草酸和18β-甘草酸的溶解性，筆者曾嘗試用甲醇、70%乙醇、水進行提取，結果70%乙醇的提取效果最好。筆者還曾嘗試采用回流提取法和超聲提取法等不同提取方法，結果超聲提取法的提取率較高；同時，亦比較了超聲20、30、45 min的提取效果，結果超聲提取30 min時18α-甘草酸和18β-甘草酸就已提取完全。

3.4 含量測定結果的分析

含量測定結果顯示，甘草藥材中18β-甘草酸含量最高者可達6.30%，而18α-甘草酸含量最高者僅為0.93%，且有部分樣品甚至未檢出，可見甘草藥材中18α-甘草酸和18β-甘草酸的含量差異較大，18β-甘草酸的含量遠高于18α-甘草酸。正因為18β-甘草酸在甘草中的含量較高，因而受到研究者的廣泛關注，對另一有效成分18α-甘草酸的研究卻往往被忽視。

文獻[7-9，11-12]曾報道，采用HPLC 法以甲醇-0.2 mol/L 醋酸銨-冰醋酸、乙腈-0.1 mol/L磷酸溶液為流動相測定甘草中18β-甘草酸含量，以乙腈-2%冰醋酸、甲醇-冰醋酸-水（三乙胺調pH至4.35）為流動相測定甘草制劑中18β-甘草酸含量的方法，但未見對甘草中另一活性成分18α-甘草酸含量測定方法的研究報道，特別是在同一流動相條件下同時檢測具有藥理活性且為同分異構體的上述兩種專屬性成分的研究報道。

綜上所述，本方法準確、可靠、簡單、快速，可用于不同商品規格甘草藥材的質量評價。

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