甘露聚糖肽滴鼻液的制備及其質量控制

金偉華，陳 華，張 明，蒲志強，鐘 妙（.成都軍區總醫院藥劑科，成都 60083；.瀘州醫學院藥學系，四川瀘州 646000）

甘露聚糖肽是從健康人口腔分離的α-溶血性鏈球菌菌株經深層培養、發酵提取而得到的一種具有免疫活性和抗腫瘤作用的糖肽類物質，其具有明顯增強人體免疫功能及抗腫瘤的作用。臨床上用于免疫功能低下、反復呼吸道感染、白細胞減少、再生障礙性貧血及腫瘤的輔助治療。目前，甘露聚糖肽已開發的劑型有片劑、口服液、膠囊劑、注射液，但尚無對甘露聚糖肽滴鼻液的研究。為此，我們研制了甘露聚糖肽滴鼻液。該制劑用于改善免疫功能低下以及免疫功能低下所致的反復呼吸道感染、肝炎、肝硬化的抗病毒治療等。將甘露聚糖肽制成滴鼻液可避免肝臟首關效應，提高藥物的生物利用度。甘露聚糖肽是具有免疫活性的糖肽類物質，目前關于復雜體系中單糖檢測尚缺少普適的高效液相色譜（HPLC）檢測方法，專用糖柱（配體交換分離）價格昂貴、易損耗且樣品前處理繁瑣[1]。多數制藥企業及藥物研發機構主要采用紫外-可見分光光度計控制甘露聚糖肽制劑的質量。1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮（PMP）是一種具有強紫外吸收的衍生試劑，該試劑可以與還原性糖在溫和條件下反應，產物無立體異構體且在紫外245 nm 波長處有強烈的吸收。因此，本研究將甘露聚糖肽水解為甘露糖，采用PMP對甘露糖進行柱前衍生，建立了甘露聚糖肽滴鼻液中甘露糖的柱前衍生化HPLC法，得到了令人滿意的結果。

1 材料

1.1 儀器

1200 型HPLC 儀（美國安捷倫公司）；AL204 型電子天平[梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司，精度：0.000 1 g]；HH-S24S 數顯恒溫水浴鍋（上海君竺儀器制造有限公司）；101-2A型電熱鼓風干燥箱（北京中興偉業儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

甘露聚糖肽原料藥（成都利爾藥業有限公司，批號：130301，藥用級）；d-甘露糖對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：140651-200602，供含量測定用）；PMP（成都市科龍化工試劑廠，批號：20120801，純度：≥99.0%）；氯化鈉（江蘇省勤奮藥業有限公司，批號：20130129，藥用級）；滅菌注射用水（四川科倫藥業股份有限公司，批號：A130402L）；水為三重蒸餾水。

2 處方與制備

2.1 處方

甘露聚糖肽10.0 g，氯化鈉6.0 g，加注射用水至1 000 ml。

2.2 制備

稱取處方量甘露聚糖肽、氯化鈉，加注射用水適量攪拌溶解后，再加注射用水至全量，攪拌均勻，加入0.1%注射用活性炭，加熱煮沸15 min，趁熱脫炭，無菌過濾，測定含量、pH等；合格后灌封于5 ml滴鼻液瓶中，進行澄明度、外觀色澤、含量、有關物質等檢查，即得甘露聚糖肽滴鼻液，設立批號為：20130415、20130419、20130422。

3 質量控制

3.1 性狀

本品應為淡黃色澄明液體。

3.2 pH

量取本品50 ml，依據2010年版《中國藥典》（二部）附錄ⅥH項下pH測定法進行測定[2]，本品pH應為5.5～7.0。

3.3 其他

其他各項（鑒別、裝量、微生物限度）檢查均應符合2010年版《中國藥典》（二部）附錄ⅠR項下鼻用制劑要求[2]。

3.4 含量測定

3.4.1 色譜條件。色譜柱：Gemini C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：乙腈-0.02 mol/L乙酸銨溶液（20∶80），流速：1 ml/min；檢測波長：250 nm；柱溫：30 ℃；進樣量：10μl。

3.4.2 甘露糖對照品貯備液的制備。精密稱取d-甘露糖對照品0.010 7 g，置于100 ml量瓶中，加水適量使溶解，用水定容至刻度，搖勻，得到質量濃度為107 μg/ml的對照品貯備液。

3.4.3 對照品溶液的制備。精密量取d-甘露糖對照品貯備液20、15、10、5 ml，分別置于25 ml量瓶中，用水定容至刻度，制備成質量濃度分別為85.6、64.2、42.8、21.4 μg/ml的對照品溶液。

3.4.4 供試品溶液的制備。精密量取甘露聚糖肽滴鼻液2 ml，置于100 ml量瓶中，用水定容至刻度，搖勻；精密量取稀釋液2 ml，置于頂空瓶中，加入3.0 mol/L的鹽酸溶液2 ml，抽真空，封口，混勻，110 ℃水解2 h，冷卻后，用3.0 mol/L的氫氧化鈉溶液調節pH至中性，即得。

3.4.5 空白溶液的制備。精密量取2 ml水，置于頂空瓶中，按“3.4.4”項下方法操作制備成不含甘露聚糖肽的空白溶液。

3.4.6 系統適用性試驗。取對照品溶液、供試品溶液、空白溶液各0.8 ml，分別加0.5 mol/L 的PMP 甲醇溶液與0.3 mol/L 的氫氧化鈉溶液[3]各0.8 ml，混勻，70 ℃水浴反應100 min。冷卻后加0.3 mol/L 的鹽酸溶液0.9 ml，用三氯甲烷洗滌3 次，每次2 ml，棄去三氯甲烷液，水層過濾后，定容至3 ml。分別精密吸取上清液各10μl，照“3.4.1”項下色譜條件注入色譜儀，記錄色譜。結果表明，空白溶液對甘露糖的測定無干擾，待測峰分離度良好，理論板數按甘露糖峰計算不低于5 000，分離度大于1.5。HPLC色譜圖見圖1。

3.4.7 線性關系考察。取“3.4.2”“3.4.3”項下107、85.6、64.2、42.8、21.4 μg/ml 的對照品溶液，按“3.4.6”項下方法衍生處理后，進樣測定，記錄色譜。以對照品質量濃度（x）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程為y＝157 25x－12.440（r＝0.999 9）。結果表明，甘露糖檢測質量濃度的線性范圍為21.4～107 μg/ml。

圖1 高效液相色譜圖A.對照品溶液；B.供試品溶液；C.空白溶液；1.PMP；2.甘露糖衍生物Fig 1 HPLC chromatogramsA.control solution；B.test sample solution；C.blank solution；1.PMP；2.mannose derivative

3.4.8 精密度試驗。取質量濃度為107 μg/ml 的對照品溶液，按“3.4.6”項下方法衍生處理后，進樣測定，連續進樣6次，記錄色譜，計算峰面積的RSD＝1.87%（n＝6），表明此方法的精密度符合要求。

3.4.9 重復性試驗。分別量取同一批樣品6 份，按“3.4.4”“3.4.6”項下方法制備成供試品溶液后衍生處理，進樣測定，記錄色譜，計算峰面積的RSD＝1.31%（n＝6），表明此方法的重復性良好。

3.4.10 穩定性試驗。取樣品1 份，按“3.4.4”“3.4.6”項下方法制備成供試品溶液后衍生處理，分別于0、1、2、4、6、24 h 內進樣測定，記錄色譜，計算峰面積的RSD＝1.03%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內穩定。

3.4.11 回收率試驗。取已知含量的樣品，精密加入甘露糖對照品溶液適量（42.8、64.2、85.6 μg/ml），制備成低、中、高3種質量濃度的溶液，按“3.4.4”“3.4.6”項下方法制備成供試品溶液后衍生處理，進樣測定，記錄峰面積，計算回收率，結果見表1。

表1 回收率試驗結果（n＝3）Tab 1 Results of recovery tests（n＝3）

3.4.12 樣品測定。取樣品3 批，按“3.4.4”“3.4.6”項下方法制備成供試品溶液后衍生處理，進樣測定，記錄峰面積，代入回歸方程計算含量，本品含甘露聚糖肽以甘露糖計算，結果見表2。

4 討論

4.1 甘露聚糖肽的水解

由于甘露聚糖肽完全由不同鏈長的甘露聚糖肽分子構成，不存在單糖、雙糖等小分子糖類，因此首先應水解甘露聚糖肽得到甘露糖。多糖的水解常采用鹽酸、硫酸、三氟乙酸。經過試驗，并權衡各種溶劑的優缺點，本研究最終采用3.0 mol/L的鹽酸溶液作為水解溶媒。

表2 樣品含量測定結果（n＝3）Tab 2 Content determination of samples（n＝3）

4.2 甘露糖的衍生化[4]

由于甘露糖沒有紫外吸收基團，不能用于紫外檢測，因此本文采用PMP化學衍生法使甘露糖帶上紫外吸收基團。PMP作為衍生化試劑，可以在溫和的水浴條件下與糖鏈進行定量反應；且HPLC法檢測甘露糖衍生物，靈敏度較高，重現性好。

4.3 pH的控制

本文的主要思路是“酸水解、堿衍生”。甘露聚糖肽在酸性條件下（pH應控制在2～5）水解，水解后應調節pH至中性；甘露糖衍生時，應保證是在堿性條件下（pH 應控制在9～12）進行的。如果pH控制不好，試驗很容易導致色譜圖中甘露糖衍生物無檢測信號。

4.4 PMP的萃取

甘露糖衍生反應結束后，在油/水兩相分離時，應充分混合溶劑，由于甘露糖衍生物太少，為了檢測甘露糖衍生物必須使三氯甲烷萃取過量的PMP。目前實驗室現有條件，利用三氯甲烷萃取PMP 已得到較好效果，雖仍然殘留部分PMP，但PMP剩余峰并不干擾目標峰的測定。

[1]王立東，張麗萍.利用木聚糖酶酶解小麥麩皮制備低聚木糖工藝參數的研究[J].黑龍江八一龍墾大學學報，2012，24（1）：61.

[2]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：二部[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：附錄17、18、44.

[3]章樂建，泮玉華，趙穎飛.高效液相色譜法測定樂清栽培的鐵皮石斛不同年份甘露糖的含量[J].海峽藥學，2012，24（3）：79.

[4]郝桂堂，陳尚衛，朱松，等.對氨基苯甲酸衍生化高效液相色譜法分析多糖中的單糖及糖醛酸組成[J].色譜，2007，25（1）：75.