益氣養(yǎng)陰活血方對糖尿病模型大鼠κ-nephrin 蛋白與P22Phox 表達的影響

張春輝，譚忠榮（華中農(nóng)業(yè)大學校醫(yī)院，武漢 430071）

糖尿病已成為對社會人群危害最大的疾病之一，其不僅可以影響體內的糖代謝系統(tǒng)，還可誘發(fā)多種并發(fā)癥，從而加重對患者的危害。目前，對于糖尿病的治療主要以西藥口服或胰島素替代治療為主，臨床治療效果較好。而基于整體觀念的中醫(yī)學對于本病的治療同樣也有著極好的作用效果，且不良反應較少。本研究以糖尿病模型大鼠為對象，對我院常用于治療糖尿病效果較好的益氣養(yǎng)陰活血方進行了基礎研究，以期為臨床應用提供理論支持。

1 材料

1.1 儀器

2315型UVP 分析儀器（挪威Nyco 公司）；NP-207型光學顯微鏡（深圳市海量光電有限公司）。

1.2 藥品與試劑

鏈脲佐菌素（STZ，美國Sigma 公司）；κ-nephrin 蛋白酶鏈免疫（ELISA）試劑盒（上海生物科技有限公司）。

1.3 動物

健康SD大鼠60只，♀♂兼半，體質量120～150g，購自湖北省實驗動物研究中心（動物使用合格證：醫(yī)動字第2007-0806號）。高脂飼料包括5%膽固醇、10%豬油、5%蔗糖、10%蛋黃粉、0.2%牛膽鹽，其余為正常飼料。

2 方法

2.1 益氣養(yǎng)陰活血方的制備

黨參30g，黃芪20g，當歸20g，地黃20g，丹參15g，川芎15g，黃精10g，地龍10g，水蛭10g。煎煮2次，每次30min，濾出，合并2次濾液濃縮至300ml。

2.2 復制模型與分組、給藥

[1]，ip STZ（25mg/kg）聯(lián)合喂飼高脂飼料以復制大鼠糖尿病模型。以空腹血糖＞7.0mmol/L和餐后2h血糖＞11.1 mmol/L 為復制糖尿病模型成功。60只SD 大鼠隨機均分為3組，即正常對照（等容生理鹽水）組、模型（等容生理鹽水）組與益氣養(yǎng)陰活血方（200ml/kg）組。ig給藥，每天早晚1次，連續(xù)給藥16周。

2.3 大鼠腎組織病理形態(tài)觀察

末次給藥后，處死大鼠，取出腎臟，剝去被膜，腎組織標本常規(guī)脫水至透明后，石蠟包埋切片（厚度2μm），Masson 染色，光鏡下攝像，觀察腎組織病理形態(tài)改變。

2.4 κ-nephrin表達的測定

末次給藥后，處死大鼠，取出腎臟，剝去被膜，將腎臟皮質作為留取標本，標本留取成功后應用液氮迅速冷凍，并應用ELISA法測定大鼠腎皮質勻漿中κ-nephrin的表達[1]。

2.5 P22Phox表達的測定

所有大鼠在斷頸處死后，取出胰腺，分離200mg，充分剪碎后裂解，常規(guī)勻漿、離心后靜置，取上清加熱使蛋白變性，隨后經(jīng)轉移、封閉及滴加一抗、二抗試劑，孵育過夜。應用UVP分析儀讀標本的校正積分光密度，以表示氧化酶亞單位22kD多肽表達的相對值[2]。

2.6 統(tǒng)計學方法

采用SPSS17.0軟件處理分析實驗數(shù)據(jù)。數(shù)據(jù)以表示，多組間單因素比較先用單因素分析其正態(tài)分布，后以（LSD）法進行統(tǒng)計。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 益氣養(yǎng)陰活血方對模型大鼠腎組織病理形態(tài)的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠腎小球體積明顯萎縮，腎小球內細胞增多、空泡變性；少數(shù)腎小球毛細血叢出現(xiàn)結節(jié)狀病變或彌漫性萎縮，并可見腎小管上皮細胞腫脹，空泡變性，間質中有灶狀淋巴細胞浸潤。與模型組比較，益氣養(yǎng)陰活血方組大鼠腎小球基質和系膜細胞數(shù)增多，腎小球囊粘連程度更高。大鼠腎組織病理形態(tài)見圖1。

圖1 大鼠腎組織病理形態(tài)（Masson 染色，400×）A.正常對照組；B.模型組；C.益氣養(yǎng)陰活血方組Fig 1 Pathological morphology of rat renal tissue（Masson，400×）A.normal control group；B.model group；C.Yiqi yangyin huoxue formula group

3.2 益氣養(yǎng)陰活血方對模型大鼠腎組織κ-nephrin 蛋白表達的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠腎組織κ-nephrin 蛋白表達減弱，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，益氣養(yǎng)陰活血方組大鼠腎組織κ-nephrin 蛋白表達增強，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。益氣養(yǎng)陰活血方對模型大鼠腎皮質κ-nephrin蛋白表達的影響見表1。

表1 益氣養(yǎng)陰活血方對模型大鼠腎皮質κ-nephrin蛋白表達的影響（，n＝20）Tab 1 Effects of Yiqi yangyin huoxue formula on the expression ofκ-nephrin protein in model rat（，n＝20）

表1 益氣養(yǎng)陰活血方對模型大鼠腎皮質κ-nephrin蛋白表達的影響（，n＝20）Tab 1 Effects of Yiqi yangyin huoxue formula on the expression ofκ-nephrin protein in model rat（，n＝20）

與正常對照組：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

3.3 益氣養(yǎng)陰活血方對模型大鼠腎皮質P22Pox 多肽表達的影響

與正常對照組比較，模型組大鼠腎組織P22Pox表達增強，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；與模型組比較，益氣養(yǎng)陰活血方組大鼠腎組織氧化酶亞單位22kD多肽表達減弱，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。益氣養(yǎng)陰活血方對模型大鼠腎皮質P22-Pox表達的影響見表2。

表2 益氣養(yǎng)陰活血方對糖尿病模型大鼠腎皮質P22Phox 表達的影響（，n＝20）Tab 2 Effects of Yiqi yangyin huoxue formula on the expression of P22Phox in DM model rat（，n＝20）

表2 益氣養(yǎng)陰活血方對糖尿病模型大鼠腎皮質P22Phox 表達的影響（，n＝20）Tab 2 Effects of Yiqi yangyin huoxue formula on the expression of P22Phox in DM model rat（，n＝20）

與正常對照組：＊P＜0.05；與模型組比較：#P＜0.05vs.normal control group：＊P＜0.05；vs.model group：#P＜0.05

4 討論

κ-nephrin蛋白主要特異性表達于腎小球臟層上皮足細胞上，屬于免疫球蛋白超家族，作為跨膜蛋白表達于足細胞的裂孔隔膜，主要發(fā)揮維持腎小球濾過屏障的作用[3]。κ-nephrin蛋白在維持足細胞中具有重要意義。研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病腎病模型小鼠中的血清κ-nephrin蛋白水平顯著下降，且尿中κ-nephrin蛋白水平升高，與腎小球足細胞密度、數(shù)量下降水平及腎功能呈正比[4]。其作用機制可能與κ-nephrin 蛋白和CD2AP、actinin4等蛋白結合，通過重新排列足細胞的足突與細胞骨架來破壞腎小球的濾過膜結構完整性有關[5]。本研究表明，益氣養(yǎng)陰活血方可明顯增強模型大鼠腎組織κ-nephrin蛋白表達。

目前，臨床已將氧化應激作為公認的糖尿病統(tǒng)一機制的啟動環(huán)節(jié)[6]。在糖尿病模型大鼠中，隨著P22Phox表達水平的上調，會促使還原型輔酶ⅡNADPH活化，進而使NADPH氧化酶依賴的ROS 生成增多，導致腎小球細胞DNA 損傷，腎小球基質沉積，促進糖尿病腎病進展[7-8]。同時研究發(fā)現(xiàn)，糖尿病患者中普遍存在與葡萄糖水平呈正相關的P22Phox水平增高，說明P22phox及NADPH的氧化應激現(xiàn)象密切相關[9]。本研究結果表明，益氣養(yǎng)陰活血方可明顯減弱模型大鼠腎組織P22Phox含量。

近年來，以整體觀為主要思想的中醫(yī)學治療方法逐漸受到重視。中醫(yī)學認為，糖尿病屬“消渴病”的范疇，其以氣陰虧虛為主要病機，同時又因患者長期氣陰虧虛，脾胃運化失司，氣血生化乏源，脾胃虧虛，則可痰濕內生，氣虛乏力，則可見瘀血內生，最終可使患者出現(xiàn)以氣陰虧虛為主，兼見痰濕內生、瘀血阻絡之證。而針對糖尿病腎病，臨床上早期分為脾腎兩虛型和肝腎陰虛型，適合采取黃芪固腎補氣，地黃滋養(yǎng)肝腎；晚期常為陰陽兩虛，采取黃精、水蛭等益氣通腑活血，起到溫補脾腎、利水泄?jié)岬淖饔肹10]。本研究中所用的益氣養(yǎng)陰活血方是基于“益氣養(yǎng)陰、化痰逐瘀”的治療原則而產(chǎn)生，其中黨參可補益氣血，用以為君；黃芪可補氣，當歸可補血，兩者合用可協(xié)助君藥達到補益氣血之效，故用以為臣；地黃可清熱涼血，丹參可涼血活血，川芎可通絡止痛，黃精可益陰填精，四藥合用可達活血化瘀、益陰通絡之效，故合用以為佐；地龍、水蛭均為通絡之藥，可在通絡同時助藥力通達全身，故用以為使[11]。

綜上所述，益氣養(yǎng)陰活血方可明顯改善糖尿病模型大鼠κ-nephrin蛋白以及P22Phox表達，對于模型大鼠的氧化應激及腎臟保護均有著積極地作用。

參考文獻

[1]李黎莉，陳志強，王月華，等.益氣養(yǎng)陰化瘀通絡中藥及其拆方對糖尿病大鼠模型nephrin蛋白的影響[J].中國中西醫(yī)結合雜志，2012，32（7）：960.

[2]吳元潔，方朝暉，鄭書國，等.丹蛭降糖膠囊聯(lián)合運動對糖尿病大鼠胰腺NADPH氧化酶亞單位p22phox表達水平的影響[J].中國中西醫(yī)結合雜志，2013，33（5）：641.

[3]孫懷鑫，孔維信，汪年松，等.環(huán)氧合酶-2基因敲低對足細胞凋亡及nephrin蛋白表達的影響[J].蘇州大學學報：醫(yī)學版，2012，32（2）：197.

[4]Isennann B，Vinnikov IA，Madbusudhan T，et al.Activated protein C protects against diabetic nephropathy by inhibiting endothelial and pedocyte apoptosis[J].Nat Med，2007，13（11）：1349.

[5]孔敏.鹽酸貝那普利對糖尿病大鼠腎臟nephrin蛋白表達及排泄的影響[D].合肥：安徽醫(yī)科大學，2012.

[6]Brownlee M.The pathobiology of diabetic complications：a unifying mechanism[J].Diabetes，2005，54（6）：1615.

[7]Li JW，Guo ZX.Effects of telmisartan on the expression of NADPH oxidase subunits in the myocardium of type 2 diabetic rats[J].Med J Chin PLA，2011，36（10）：1037.

[8]Persson P，Hansell P，Palm F.NADPH oxidase inhibition reduces tubular sodium transport and improves kidney oxygenation in diabetes[J].Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol，2012，30（12）：R1443.

[9]Newsholme P，Morgan D，Rebelato E，et al.Insights into the critical role of NADPH oxidase（s）in the normal and dysregulated pancreatic beta cell[J].Diabetalogia，2009，52（12）：2489.

[10]陳菲菲.益氣養(yǎng)陰活血方治療糖尿病腎病的實驗研究及遠期療效觀察[D].北京：中國中醫(yī)科學院，2012.

[11]楊曉燕，王開成，方朝暉.益氣養(yǎng)陰活血方對胰島素抵抗大鼠血清纖溶酶原激活物抑制物的影響[J].中國實驗方劑學雜志，2008，14（5）：56.