正交試驗優選當歸補血口服液的超濾工藝Δ

余 琰，范凌云，魏舒暢，高建德，馬立新（.甘肅中醫學院藥學院，蘭州 730000；.蘭州佛慈制藥股份有限公司，蘭州 730046））

當歸補血口服液是由當歸和黃芪兩味中藥組成，收載于2010年版《中國藥典》（一部）[1]，具有補養氣血，提高機體免疫功能的作用，且療效確切、應用十分廣泛。傳統純化方法采用醇沉法，但工藝流程長、產品黏度大，且含有大量的微粒、亞微粒和絮狀物等沉淀[2]，放置時間久也易產生沉淀，從而影響產品質量外觀。為避免有效成分的損失并提高產品的外觀質量，本研究采用超濾工藝對其進行純化并優選最佳工藝參數以提高當歸補血口服液的品質，并對超濾法在該制劑中的應用提供依據。

1 材料

1.1 儀器

1100型液相色譜儀，包括1100系列二元泵、ELSD·2000型蒸發光散射檢測器、Agilent Chemstation 色譜工作站（美國Agilgent 公司）；UV-1800PC 型紫外-可見分光光度計（上海美譜達儀器有限公司）；KQ-250型超聲儀（昆山市超聲儀器有限公司）；LQ10-2.4型低速離心機（北京醫療儀器修理廠）；LG10-2.4A型高速離心機（北京時代北利離心機有限公司）；中空纖維超濾裝置（天津膜天膜工程技術有限公司）。

1.2 藥材

當歸、黃芪購于蘭州黃河藥市，經蘭州佛慈制藥股份有限公司馬立新高級工程師鑒定為真品。

1.3 試劑

黃芪甲苷對照品（中國食品藥品檢定研究院，批號：106541-201106）；乙腈為色譜純，葡萄糖、乙醇等均為分析純。

2 方法與結果

2.1 藥液的制備

按處方比例準確稱取藥材1600g，加12倍量水煎煮提取2次，每次2h[3]，合并提取液。提取液以離心半徑為15cm、3000 r/min離心10min，取上清液備用。

2.2 黃芪甲苷含量的測定

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取黃芪甲苷對照品適量，以甲醇溶解并稀釋制備成質量濃度為59.12μg/ml 的黃芪甲苷對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 精密量取當歸補血口服液10ml，用水飽和的正丁醇提取4次，每次20ml，合并正丁醇液，加氨試液30ml，振搖，放置2h以上，分取正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇溶解并轉移至5ml量瓶中，加甲醇定容、搖勻、濾過，取續濾液，即得[4]。

2.2.3 陰性樣品溶液的制備 取當歸飲片適量，按“2.1”項下方法制備缺黃芪的陰性樣品貯備液，精密量取陰性樣品貯備液10ml，按“2.2.2”項下方法制備陰性樣品溶液。

2.2.4 色譜條件和系統適用性試驗 色譜柱：依利特ODS-C18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：乙腈-水（36∶64，V/V），流速：1.0ml/min；柱溫：室溫；進樣量：10μl；漂移管溫度：75℃；載氣（氮氣）流量：2.8L/min。理論塔板數按黃芪甲苷峰計算應不低于4000。以上述色譜條件分別進樣測定對照品溶液、供試品溶液。結果，黃芪甲苷主峰與其他色譜峰分離良好，表明本法具有較強的專屬性。色譜見圖1。

圖1 高效液相色譜圖A.黃芪甲苷對照品；B.當歸補血口服液樣品；C.陰性樣品Fig 1 HPLC chromatogramsA.astragaloside Ⅳcontrol；B.Danggui buxue oral liquid；C.negative sample

2.2.5 標準曲線的制備 精密量取“2.2.1”項下對照品溶液1、2、4、6、10μl，分別按“2.2.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以黃芪甲苷進樣量（x，ng）為橫坐標，峰面積積分值（y）為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程為y＝1.319x+3.048（r＝0.9998，n＝5）。結果表明，黃芪甲苷進樣量在59.12～591.2 ng范圍內與峰面積積分值呈良好線性關系。

2.2.6 精密度試驗 精密量取“2.2.1”項下對照品溶液10μl，連續進樣6次，按“2.2.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。結果，黃芪甲苷峰面積的RSD＝1.03%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.2.7 重復性試驗 取同一批樣品適量，共6份，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，以外標兩點法計算樣品中黃芪甲苷的含量。結果，黃芪甲苷的RSD＝0.76%，表明本方法重復性良好。

2.2.8 加樣回收率試驗 精密量取已知黃芪甲苷含量（0.1398 mg/ml）的當歸補血口服液5ml，共6份，分別精密加入黃芪甲苷對照品，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，計算加樣回收率（n＝6）。加樣回收率試驗結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果Tab 1 Results of recovery tests

2.2.9 樣品含量測定 取樣品適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2.3”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，測得峰面積積分值結果帶入標準曲線方程，計算黃芪甲苷含量。

2.3 總多糖的測定

2.3.1 標準曲線的制備 精密稱取105℃下干燥至恒質量的葡萄糖25.4mg，參考文獻方法[5]，在490nm 波長處測吸光度（A）。以總多糖質量濃度（c）為橫坐標，A為縱坐標，進行線性回歸，得回歸方程為A＝16.2058c+0.0175（r＝0.9998）。結果表明，總多糖質量濃度在0.01017～0.06102mg/ml范圍內與A呈良好線性關系。

2.3.2 總多糖樣品的制備 分別精密吸取“2.1”項下提取液12.5ml，加入無水乙醇5.0ml 使含醇量達85%，靜置24h 后，以離心半徑5cm、3700r/min 離心10min，沉淀加純化水溶解，轉移至25ml量瓶中，以純凈水定容。

2.3.3 總多糖的含量測定 精密吸取總多糖樣品液2.0ml，在490nm波長處測A，由回歸方程計算出總多糖含量。

2.4 超濾工藝的優選

以影響超濾效果的工作壓強（A）、藥液溫度（B）、藥材與提取液質量比（C）為考察因素，每個因素選取3個水平，采用L9（34）正交表進行試驗。考核指標采用綜合評分法，以超濾前藥液所含總多糖、總皂苷的量計為100分，以超濾后的總多糖、總皂苷保留率依次評分。綜合得分＝總多糖保留率得分×60%+黃芪甲苷保留率得分×40%。因素與水平見表2；正交試驗結果見表3；方差分析結果見表4。

表2 因素與水平Tab 2 Factors and levels

表3 正交試驗結果Tab 3 Results of orthogonal test

表4 方差分析結果Tab 4 Analysis of variance

由表2～表4可知，優選的超濾工藝條件為A2B2C3，即工作壓強0.75MPa，藥液溫度30℃，藥材與提取液質量比1∶8（m/m）。

2.5 工藝驗證試驗

分別按處方比例準確稱取藥材1600g，共3批，采用上述優選工藝所得參數對最佳超濾工藝條件進行復核。結果表明，優選超濾工藝綜合評分平均為91分，且所得工藝穩定。驗證試驗結果見表5。

表5 驗證試驗結果Tab 5 Results of validation tests

3 討論

當歸補血口服液藥理學研究表明，當歸中的多糖、黃芪中的多糖類、黃芪甲苷是非常重要的藥效成分，且有研究表明多糖部分的補血活性強于非多糖部分[6]。因此，本研究在考察超濾純化工藝時以黃芪甲苷、總多糖保留率為指標，且加大多糖的權重系數，能較好地反映超濾液的內在品質。

考慮到多糖分子量較大，又是本方中的重要藥效成分之一，在參考了文獻后[7-9]，本研究選擇分子截留量為10萬的超濾膜，既能達到較好的純化效果，還能較好地保留有效成分，提高當歸補血口服液的內在品質。

[1]衛生部藥典委員會.新藥轉正標準：第34冊[S].北京：人民衛生出版社，1997：15.

[2]李霞，馬家驊，李楠，等.當歸補血湯相狀態的研究[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17（2）：1.

[3]王永祿，王麗瑤，張東旭.正交實驗法優選當歸補血湯提取工藝的研究[J].時珍國醫國藥，2008，18（6）：1435.

[4]國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：二部[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：687、616.

[5]楊莉，王志華，陶健生.黃芪中黃芪多糖含量測定方法的比較[J].中國醫藥工業雜志，2005，36（9）：562.

[6]范穎.當歸補血湯的實驗研究進展[J].中醫藥學刊，2006，24（9）：1643.

[7]楊祖金，江燕斌，葛發歡，等.超濾膜技術分離靈芝多糖的研究[J].中藥材，2009，32（1）：126.

[8]魏舒暢，余琰，王志旺，等.補陽還五湯超濾工藝優選條件的評價與優化[J].中成藥，2009，31（2）：304.

[9]陳彥佐，馮怡，徐德生，等.膜技術在多糖分離應用中存在問題探討[J].中草藥，2009，40（6）：991.