AM真菌和PGPR菌劑組合對低溫脅迫下黃瓜生長及防御酶活性的影響

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（1青島農業大學菌根生物技術研究所，山東青島 266109；2青島農業大學園藝學院，山東青島 266109）

AM真菌和PGPR菌劑組合對低溫脅迫下黃瓜生長及防御酶活性的影響

韓亞楠1，2劉潤進1李 敏1，2*

（1青島農業大學菌根生物技術研究所，山東青島 266109；2青島農業大學園藝學院，山東青島 266109）

為了篩選適于黃瓜耐低溫的最佳叢枝菌根（AM）真菌和PGPR組合菌劑，研究了不同AM真菌、PGPR組合菌劑對低溫脅迫下黃瓜生長及防御酶活性的影響。結果表明低溫脅迫下，單接種AM真菌或是單接種PGPR的處理，其黃瓜生長量及SOD、POD和CAT活性均高于不接種對照，而MDA含量則顯著低于不接種對照。AM真菌接種處理中以接種地表球囊霉（Glomus versiforme）處理的黃瓜生長量較大、防御酶活性較高、細胞膜受傷害較小；PGPR接種處理中以接種多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa）的處理黃瓜生長量較大、防御酶活性較高、細胞膜傷害較小。AM真菌和PGPR雙接種處理中，以地表球囊霉+多粘類芽孢桿菌處理生長量最大、防御酶活性最高、細胞膜傷害最輕。可以考慮在今后溫室黃瓜種植中添加該組合菌劑促進黃瓜生長，提高植株耐冷性。

低溫脅迫；AM真菌；PGPR；黃瓜；防御酶；丙二醛

黃瓜（Cucumis sativus L.）是典型喜溫蔬菜作物，不耐低溫，通常在10～13℃生理活動失調，停止生長發育，低于1℃則發生凍害（章鎮，2004）。北方地區冬春季經常會出現極度寒冷天氣和連陰天現象是影響設施黃瓜生產的主要逆境，黃瓜的冷敏性已成為其正常生長的主要限制因子。近年來，黃瓜低溫冷害問題受到了廣泛關注，制定克服低溫與弱光等不良條件影響的技術措施已成為研究熱點。

叢枝菌根（arbuscular mycorrhizal，AM）真菌是一類植物活體營養專性共生菌，接種AM真菌能夠促進植物萌發、生根和生長，提高植物抗病性（李敏 等，2003；Diedhiou et al.，2003）和抗逆性（Vivas et al.，2003；楊瑞紅 等，2005），促進作物生長，改善品質（王曙光 等，2002）。

植物根圍促生細菌（plant growth-promotingrhizobacteria，PGPR）是指自由生活在土壤或附生于植物根圍的一類具有固氮、解磷、產生植物激素或分泌抗生素、促進植物生長的有益細菌（Shafiq et al.，1999）。已從根圍細菌中鑒定出一些PGPR，主要包括假單胞菌屬（Pseudomonas）和芽孢桿菌屬（Bacillus）；其中熒光假單胞菌（Pseudomonas fluorescens）在很多植物的根圍和根面都占有絕對優勢，其數量可占細菌總量的60%～93%。此外，醋桿菌屬（Acetobacter）、堿菌屬（Alcaligenes），節桿菌屬（Arthrobacter）、固氮菌屬（Azotobacter）等中的部分細菌也是比較常見的PGPR（Weller，1998）。PGPR對植物不僅沒有致病性，而且對植物具有防病作用和促生作用，作為生防菌廣泛用于農業生產中。

關于接種AM真菌或接種PGPR促進植物生長的研究已有不少，隨著研究的深入，人們發現AM真菌和PGPR雙接種比單接種有更大的效益（龍偉文 等，2000），焦慧等（2010）發現番茄播種時接種AM真菌摩西球囊霉（Glomus mosseae）+移栽時接種芽孢桿菌（Bacillus sp.） 能夠顯著增加番茄植株節點數、株高、莖粗、地上部鮮質量及地下部鮮質量。由于AM真菌和PGPR種類繁多，AM真菌和PGPR之間相互影響的機制尚不清楚，因此關于AM真菌和PGPR菌劑組合研究甚少，本試驗研究了低溫脅迫下接種AM真菌和PGPR對黃瓜生長及防御酶活性的影響，以期篩選出能夠使黃瓜耐低溫的優良菌劑組合。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試黃瓜品種為津優35號，將黃瓜種子用75%酒精消毒后浸種12 h，放在墊有濾紙的培養皿中，置于28℃恒溫培養箱中催芽，出芽后播種。

供試AM真菌菌劑有地表球囊霉（Glomus versiforme，Gv）、摩西球囊霉（G. mosseae，Gm）兩種，由青島農業大學菌根生物技術研究所提供。菌種是經三葉草在滅菌沙土中擴繁4～5個月，以菌根化根段、土壤中的菌絲體和根圍土壤組成的接種混合物。

供試PGPR有蠟狀芽孢桿菌（Bacillus cereus，BC）、多粘類芽孢桿菌（Paenibacillus polymyxa，PP）兩種。把菌株轉移到牛肉膏蛋白胨液體培養基上，28℃下振蕩培養30 h。PGPR懸浮液均稀釋到濃度為3×108cfu·mL-1。

1.2 試驗設計

試驗于2013年8月6日至11月3日在青島農業大學日光溫室和人工氣候箱進行。試驗用基質為土∶沙∶蛭石∶草炭=2 V∶1 V∶1 V∶1 V，基質用高壓滅菌鍋121℃滅菌1 h，滅菌后裝入用酒精消毒的16 cm×22 cm花盆中。經預備試驗后，根據黃瓜植株生長狀況篩選出優勢菌種為Gm、Gv、PP、BC、Gv+BC、Gv+PP、Gm+PP。試驗設不接種對照（CK）和7個菌劑處理，分別為Gm、Gv、BC、PP、Gv+BC、Gv+PP、Gm+PP，隨機排列，每個處理3次重復。種子發芽后播種，播種前將5 000接種勢單位（IPU）AM真菌接種物加入花盆（Liu ＆Luo，1994），對照則加入等量的滅菌混合接種物和接種物濾液，每盆播2 粒。保持晝溫 27～30℃、夜溫 16～18℃，出苗后每盆留1株苗，待幼苗子葉出土后每2 d澆1次水，黃瓜生長至三葉一心時灌根接種PGPR懸浮液，每株接10 mL。接種PGPR 20 d后將所有處理移至人工氣候箱（光暗各12 h，光照強度為 150 μmol·m-2·s-1）內進行15℃/10℃（晝/夜）低溫處理，低溫處理6 d后取樣。黃瓜生長期間適當補充Hoagland營養液，其他常規管理。

1.3 測定指標

取樣后采用常規方法測定地上部、地下部鮮質量、植株高度、莖粗、根長。

采用硫代巴比妥酸（TBA）法測定丙二醛（MDA）的含量，采用氮藍四唑法測定超氧化物歧化酶（SOD）活性，采用愈創木酚法測定過氧化物酶（POD）活性，采用紫外吸收法測定過氧化氫酶（CAT）活性（劉萍和李明軍，2008）。

1.4 數據分析

采用Microsoft Excel 2003軟件對數據進行處理，采用DPS7.05軟件對數據進行LSD顯著性分析。

2 結果與分析

2.1 AM真菌與PGPR菌劑組合對低溫脅迫下黃瓜生長量的影響

由表1可以看出，低溫處理后，單接種AM真菌的各項指標都顯著高于不接種的對照，其中接種Gv處理的各項指標較好，地上部鮮質量、地下部鮮質量、株高、莖粗和根長分別比對照增加299.3%、773.0%、526.2%、100.0%和122.9%，并顯著高于接種Gm的處理；在單接種PGPR的處理中，接種PP處理的各項指標除地上部鮮質量外均顯著高于對照，地上部鮮質量、地下部鮮質量、株高、莖粗、根長分別比對照增加67.4%、143.2%、113.9%、25.7%和47.6%，接種BC處理的各項指標除根長外與對照差異不顯著；單獨接種AM真菌處理的各項指標要優于單獨接種PGPR的處理；AM真菌與PGPR菌劑組合處理中，Gv+PP處理的各項生長指標最高，地上部鮮質量、地下部鮮質量、株高、莖粗、根長分別比對照增加390.7%、881.1%、660.0%、119.0%、176.5%。

表1 不同菌劑組合對低溫脅迫下黃瓜生長量的影響

2.2 AM真菌與PGPR菌劑組合對低溫脅迫下黃瓜防御酶活性的影響

2.2.1 AM真菌與PGPR菌劑組合對低溫脅迫下黃瓜葉片SOD、POD、CAT活性的影響 由圖1可知，低溫處理后，各接種處理植株葉片的SOD、POD活性都顯著高于不接種的對照，除了BC接種處理外，其他接種處理植株葉片CAT活性也都顯著高于不接種的對照；在單接種AM真菌的處理中，接種Gv處理的SOD、POD、CAT活性較高；在單接種PGPR的處理中，接種PP處理的SOD、POD、CAT活性較高；單獨接種AM真菌的處理的SOD、POD、CAT活性（Gm處理的POD活性除外）要高于單獨接種PGPR的處理，同時接種AM真菌和PGPR的處理比單接種AM真菌或PGPR處理的SOD、CAT活性高，其中接種組合菌劑Gv+PP的葉片SOD、POD、CAT活性最高。

圖1 不同菌劑組合對低溫脅迫下黃瓜葉片SOD、POD、CAT活性的影響

2.2.2 AM真菌與PGPR菌劑組合對低溫脅迫下黃瓜葉片MDA含量的影響 由圖2可知，低溫處理后，各接種處理植株葉片的MDA含量都顯著低于不接種的對照；單接種AM真菌的處理中，接種Gv處理的MDA含量較低；單接種PGPR的處理中，接種PP處理的MDA含量較低； Gv+PP處理的葉片MDA含量最低，顯著低于單接種AM真菌或PGPR處理。

圖2 不同菌劑組合對低溫脅迫下黃瓜葉片MDA含量的影響

3 結論與討論

一些研究已經證實了AM真菌與PGPR雙接種能夠促進植物生長，例如，AM真菌G. fasculatum與固氮螺菌Azospirillum brasilense雙接種對紫花苜蓿生長及氮的吸收都具有促進作用（Biró et a1.，2000）；對玉米接種摩西球囊霉和重氮營養醋桿菌Pal5可極顯著地提高菌根侵染率，促進玉米生長，增加產量（宣梅 等，2004）。相似研究已有不少，但在低溫脅迫下，AM真菌與PGPR組合對黃瓜生長及防御酶活性有何影響少有人研究，而哪種菌劑組合能夠使在低溫脅迫下處理的黃瓜植株達到最佳生長狀況更是研究甚少。本試驗中，不同菌劑處理的黃瓜植株的生長量差異較大，其中，接種Gv+PP的植株各項生長指標最高。可以看出，AM真菌和PGPR都顯著地發揮了其促生作用，但是不同組合促生效果不同，這可能是與AM真菌和PGPR之間相互促進、相互抑制或互不影響有關（Biró et al.，2000；Mamatha et al.，2002；Duponnois &Plenchette，2003）。

單獨接種兩種PGPR均促進了黃瓜生長，原因是多方面的。多粘類芽孢桿菌能產生肽類、蛋白質類、核苷類、酚類等多種抗菌物質，能防治多種植物病害（李蜀 等，2007），并能通過固氮和溶磷作用為宿主植物提供營養成分（陳志誼，2001），還能產生多種生物活性物質，如酶、植物激素及絮凝劑等（Richardson et al.，2009）。蔡學清等（2005）研究表明，枯草芽孢桿菌BS-2 對辣椒苗有明顯的促生作用，同時，該菌株還可誘導辣椒體內吲哚乙酸等促進植物生長的激素含量提高，并降低脫落酸等抑制植物生長激素的形成。Tang（1996） 利用高壓液相色譜分析了7株蠟狀芽孢桿菌增產菌的發酵液中的植物生長激素類物質，分析表明玉米素、赤霉素和吲哚乙酸普遍存在于所有菌株中，吲哚乙酸含量穩定且較高，證明增產菌促進植物生長發育的主要原因之一是其產生的植物激素。

試驗中單獨接種兩種AM真菌均不同程度地促進了黃瓜植株生長，其促進效果高于接種PGPR的。AM真菌能促進生長在于能夠擴大植物根系的吸收面積、增加植物對磷及其他多種礦質元素的吸收和利用、改善植株營養狀況（Manjula et al.，2005；劉潔 等，2011；李少朋 等，2013）、改變植物內源激素的平衡狀況（劉潤進 等，2000）、促進光合作用，提高葉綠素含量（杜照奎和何躍軍，2011）。本試驗結果表明AM真菌促生效果高于PGPR，前人的研究也得到過類似結論，秦芳玲等（2000）在土培及沙培條件下接種巨大芽孢桿菌及AM真菌，發現單獨接種巨大芽孢桿菌對紅三葉草生長及磷營養狀況影響不大，而單獨接種摩西球囊霉則顯著促進紅三葉草生長和對磷的吸收，而雙接種兩者則表現出明顯的協同作用。

本試驗中，低溫脅迫下單接種AM真菌、單接種PGPR和雙接種的處理SOD、POD和CAT活性均高于不接種的對照，說明接種處理提高了植株酶活性，增強了對活性氧的清除能力，從而增強了植株抵抗低溫逆境的能力。本試驗中，低溫脅迫下各接種處理MDA含量均低于不接種的對照，表明接種后植物對低溫逆境的抗性增強，減小了膜傷害，其中雙接種處理Gv+PP植株MDA含量最低，顯著低于其他處理，其膜傷害最輕。

在本試驗中，綜合植物生長量和防御酶活性，認為兩種PGPR中多粘類芽孢桿菌促生效果較好、使得黃瓜對低溫脅迫抗性較強；兩種AM真菌中地表球囊霉促生效果較好、使得黃瓜對低溫脅迫抗性較強；在組合菌劑中，最佳組合是地表球囊霉+多粘類芽孢桿菌，其黃瓜生長量及防御酶活性都最高。總之，接種AM真菌和/或PGPR能削弱冷脅迫對SOD、CAT和POD活性的抑制和膜的傷害，從而提高黃瓜苗的耐冷性。可以考慮在今后黃瓜種植中添加組合菌劑促進黃瓜生長，提高耐冷性。

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Effects of Arbuscular Mycorrhizal Fungi and PGPR Combination Agents on Growth and Defense Enzyme Activity of Cucumber under Low Temperature Stress

HAN Ya-nan1，2，LIU Run-jing1，LI Min1，2*

（1Mycorrhizal Biotechnology Institue of Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，Shandong，China；2Horticulture College of Qingdao Agricultural University，Qingdao 266109，Shandong，China）

In order to select the best combination of arbuscular mycorrhizal（AM） fungi and plant growthpromoting rhizobacteria（PGPR） for cucumber （Cucumis sativus）to resist low-temperature damages，we studied the effects of different combinations on growth and defense enzymes in greenhouse under low temperature stress conditions. The results showed that the growth of cucumber and SOD，POD，CAT activities were higher than that of the non-vaccinated control，while MDA content was significantly lower than that of the controls，when inoculation with AM fungi or PGPR under low temperature treatments. Between the AM fungi inoculation treatments，Glomus versiforme had better positive effect on growth，defensive enzyme activities，and decreased the cell membrane damage. Between the PGPR inoculation treatments，Paenibacillus polymyxa had better growth and higher defensive enzyme activities，with less cell membrane damage. Among the inoculation treatments with AM fungi and PGPR ，inoculation treatment with both Glomus versiforme and Paenibacillas polymyxa had the best growth，highest defensive enzyme activities，minimum cell membrane damage. Hence，we would suggest to add this combination in greenhouse cucumber production to promote cucumber growth and improve plant cold resistance.

Low temperature stress；AM fungi；PGPR；Cucumber；Defense enzymes；MDA

韓亞楠，碩士研究生，專業方向：蔬菜栽培生理，E-mail：hanyananhaoren@163.com

*通訊作者（Corresponding author）：李敏，博士，教授，專業方向：蔬菜栽培生理，E-mail：ml0519@163.com

2014-04-26；接受日期：2014-05-20

“十二五”國家科技支撐計劃重點項目（2014BAD05B03），山東省科技發展計劃項目（2013GNC11014），青島市基礎研究項目（13-1-4-143-jch）