疑患EMS/AHPNS對蝦中檢出黃頭病毒的一種新株型*

劉 群 黃 倢 楊昊霖 楊 冰 劉 筍王海亮 王勤濤 劉 飛 張慶利

(1.農業部海洋漁業可持續發展重點實驗室 中國水產科學研究院黃海水產研究所 青島 266071;2.上海海洋大學 上海 201306)

2010年以來,越南和我國海南養殖的凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei)相繼出現不明原因的疫病,并導致了較高的對蝦死亡率,對越南對蝦養殖業造成了毀滅性打擊。2011年在馬來西亞發現該疫病,2012年泰國也出現流行。因該不明疾病最初的表現是,養成期投苗30d左右后的對蝦出現不尋常的高死亡率,因此被稱為早期死亡綜合征(early mortality syndrome,EMS)。2012年8月,亞太水產養殖中心網絡(NACA)針對此次突發的對蝦疾病,召集全球知名對蝦病害專家在泰國召開緊急咨詢會,確定該疫病已感染的對蝦種類包括凡納濱對蝦、斑節對蝦(Penaeus monodon)、中國明對蝦(Fenneropenaeus chinensis)等,表觀癥狀為肝胰腺蒼白、萎縮,軟殼,胃腸空或內容物不連續,放苗后最早10d就能發病死亡,瀕死蝦不常出現在池邊或水面,而是沉入池底;組織病理學表現為對蝦肝胰腺盲管從中段到末端進行性變性,B、F和R細胞功能紊亂,部分細胞核膨大,肝胰腺盲管上皮細胞壞死或脫落,在后期肝胰腺盲管間或盲管內血細胞浸潤,肝胰腺被細菌二次感染,因此該疫病被定義為急性肝胰腺壞死綜合征(Acute hepatopancreas necrosis syndrome,AHPNS),但在該會上以及至今國際上尚未能確定該疫病是由某種特定病原引起還是由毒素所致(NACA,2012)。

黃頭病毒(yellow-head virus,YHV)屬于頭甲病毒屬(Okavirus),桿套病毒科(Roniviridae),套式病毒目(Nidovirales)(Cowleyet al,2012),于1990年首次在泰國養殖斑節對蝦中被發現,YHV基因型1所引起的黃頭病(Yellow head disease,YHD)被世界動物衛生組織(World Organization for Animal Health,OIE)水生動物疫病名錄收錄,引起斑節對蝦(Chantanachookinet al,1993)、凡納濱對蝦(Sittidilokratnaet al,2009)等大量死亡。此前在我國養殖對蝦中沒有檢出過,也沒有針對中國明對蝦宿主的相關報道。本研究在我國發生疑似AHPNS的凡納濱對蝦及中國明對蝦樣品中檢測到YHV的新基因型毒株,為揭示AHPNS的病原提供了重要信息,也表明我國對蝦養殖產業已面臨了新的疫病威脅,值得高度關注。

1 材料與方法

1.1 樣品采集與處理

2012年 6月自河北某對蝦養殖場采集發病中國明對蝦成蝦,對蝦大小8—10cm;2013年1月自福建某對蝦養殖場采集發病凡納濱對蝦幼蝦,個體大小4—5cm;2013年3月自廣東某對蝦育苗場采集凡納濱對蝦親蝦,個體大小 16—18cm。采集的河北對蝦新鮮樣品保存于-80°C,留作RNA提取用,而另外兩地對蝦肝胰腺樣品使用RNAlater(Qiagen)保存于1.5mL RNase-free離心管,留作提取RNA使用,三地對蝦樣品均取頭胸部,用 Davidson’s AFA 固定液固定 24h,換75%乙醇長期保存,組織留作組織病理切片使用。

1.2 組織病理切片制作

Davidson’s AFA 固定液固定的對蝦樣品進行石蠟組織切片和蘇木精-伊紅染色(Bell,1988),封片后,于光學顯微鏡(Nikon E800,日本)下觀察結果。

1.3 RNA的提取

從 RNAlater保存的樣品上切取一小塊于RNase-free水中10min后,放入800μL TRIzol Reagent(Invitrogen)中;冰凍樣品切取小塊后直接放入 800μL TRIzol Reagent(Invitrogen)中。使用RNase-free研磨棒對樣品進行組織研磨,研磨后向其中加入160μL氯仿,振蕩混勻后室溫靜置15min,4°C,12000rpm離心15min;取上層水相,加入等體積冰浴異丙醇,混勻后室溫放置5min,4°C,12000rpm離心10min,沉淀加入1mL冰浴75%乙醇小心混勻,室溫靜置5min,4°C,12000rpm 離心 5min,沉淀晾干,加入 50μL RNasefree水溶解,并經核酸蛋白測定儀(NANO Drop 2000,USA)測定其濃度與純度,置于-80°C保存。

1.4 YHV的套式RT-PCR

1.4.1 cDNA的合成 參考《Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals》(OIE,2012)推薦的關于YHV的標準檢測方法進行樣品檢測,同時設置凡納濱對蝦 β-actin基因作為內參對照。所使用的引物的目標基因為YHV-PmA replicase polyprotein 1ab gene(EU977578),序列見表1。

取 2μL RNA,加入引物 Y1 和 Y2(50μmol/L)各0.7μL、2.6μL RNase-free H2O,混勻后離心,70°C 反應 10min后,向體系中加入 2μL 5×MMLV Buffer、1μL RNase inhibitor(40U/uL,TaKaRa)、 0.5μL dNTP(10mmol/L),42°C預熱2min,加入0.5μL MMLV逆轉錄酶(200U/μL,TaKaRa),42°C 保溫 1h,70°C 反應10min。以此合成的cDNA作為檢測YHV用模板。

于此同時,按照 Prime Script?1ststrand cDNA synthesis Kit(TaKaRa)說明書進行基因組cDNA的合成,將逆轉錄樣品預混置于65°C 5min后,冰上淬冷,配制逆轉錄酶反應液,緩慢混勻,30°C 10min,42°C 1h,95°C 5min。以此合成的cDNA作為設置內參對照用模板。

表1 用于PCR擴增的引物序列Tab.1 Primers sequences for PCR amplification

1.4.2 第 1步 PCR 在 PCR 管中加入 2.5μL 10×Taq PCR Buffer(Mg2+free,TaKaRa)、1.5μL MgCl2(25mmol/L)、0.5μL dNTP(10mmol/L)、引物 Y1 和 Y2(50μmol/L)各 0.35μL、0.25μL Taq DNA 聚合酶(5U/μL)、19.05μL RNase-free H2O,85°C 預熱 3min 后,加入 0.5μL cDNA,擴增反應程序為:95°C 30s、66°C 30s、72°C 45s,35 個循環;72°C 7min,4°C 保溫。

1.4.3 第 2步 PCR 在 PCR 管中加入 2.5μL 10×Taq PCR Buffer(Mg2+free,TaKaRa)、1.5μL MgCl2(25mmol/L)、0.5μL dNTP(10mmol/L)、引物 Y2 和 Y3(50μmol/L)各 0.35μL、0.25μL Taq DNA 聚合酶(5U/μL)、18.55μL RNase-free H2O,85°C 預熱 3min 后,加入 1μL第 1步 PCR反應產物,擴增反應程序為:95°C 30s、66°C 30s、72°C 45s,35 個循環;72°C 7min,4°C保溫。并對兩步PCR產物進行1%瓊脂糖凝膠電泳,使用凝膠成像儀(培清)進行照相。

1.5 三地樣品的快速高靈敏度檢測試劑盒檢測

采用 YHV快速高靈敏度檢測試劑盒(張慶利等,2011)的改進型號(中國水產科學研究院黃海水產研究所海水養殖生物疾病控制與分子病理學實驗室),分別對來自三地的樣品所提取的RNA按試劑盒說明書進行檢測。

2 結果

2.1 對蝦癥狀

在河北某對蝦養殖場發病池邊的淺水區不容易看到瀕死蝦,通過撒網撈取發病的中國對蝦,觀察對蝦發病癥狀,與正常對蝦相比,發現對蝦肝胰腺區域顏色變淺發黃,部分對蝦肝胰腺明顯萎縮,空胃,空腸,腸道略微腫脹,腹節肌肉輕微渾濁。在福建某對蝦養殖場池邊撈取的發病凡納濱對蝦通體白濁,甲殼軟,與肉之間有分離感,肝胰腺顏色淺。在廣東某對蝦育苗場發現凡納濱對蝦親蝦肝胰腺顏色淺,部分出現萎縮,空腸空胃,腹節肌肉輕微渾濁,部分對蝦呈現黑鰓或黃鰓。

2.2 病理組織切片

河北某對蝦養殖場樣品的肝胰腺盲管間以及肝胰腺區域中腸上皮血淋巴細胞浸潤,部分盲管完全被細菌感染,并被大量血淋巴細胞包裹形成結節(圖1a),肝胰腺盲管上皮的B、R和F細胞消失,部分上皮細胞核腫大(圖1b),中腸和肝胰腺浸潤的血淋巴細胞以及淋巴器官中可觀察到較多的核固縮、破裂和嗜堿性細胞質包涵體(圖1c)。福建對蝦樣品的肝胰腺組織盲管間存在血細胞浸潤,部分肝胰腺盲管上皮細胞層萎縮變薄(圖1d),肝胰腺盲管上皮的B、R和F細胞消失,部分細胞核腫大,并存在細胞核仁膨大形成包涵體樣(圖1e、圖1f)。在廣東對蝦樣品的肝胰腺盲管間也觀察到血淋巴細胞浸潤(圖1g),肝胰腺盲管上皮的B、R和F細胞消失(圖1g、圖1h),部分細胞核腫大(圖1h),肝胰腺盲管上皮層萎縮,與盲管膜分離(圖1g、圖1i)。

2.3 套式PCR檢測結果

采用OIE手冊推薦的YHV檢測的套式PCR方法,檢測來自河北、廣東、福建的對蝦樣品(圖2),第1步 PCR反應結果表明,來自河北對蝦樣品可得到794bp目的條帶,而其余兩地來源對蝦樣品在第1步PCR后未能得到此目的條帶;第1步PCR反應后,三地樣品均可擴增得到277bp目的條帶。

2.4 三地樣品中未知病原與YHV/鰓聯病毒(GAV)的同源性及其系統發育分析

將以上目的產物測序,經NCBI BLAST后(表2)可以看出,河北疑患 AHPNS樣品的 YHV檢測第 1步PCR反應產物的引物間的748bp目的條帶的序列(YHV_AHPNS_hb2012,KF278563)與 YHV 1992(FJ848673.1)相應區段的相似性為 87%;河北(YHV_AHPNS_hb2012,KF278563)、福建(YHV_AHPNS_fj2013,KF278564)及廣東(YHV_AHPNS_gd2013,KF278565)疑患 AHPNS樣品中的 YHV檢測第 2步PCR反應產物的引物間的 229bp目的條帶的序列與YHV1995(FJ848674.1)的相應區段的相似性分別為89%、86.4%和76.5%。

由第1步PCR產物序列構建系統發育樹,結果表明,YHV_AHPNS_hb2012(KF278563)與 YHV(EU487200)、YHV 1995(FJ848674)、YHV-PmA(EU977578)、YHV 1992(FJ848673)、YHV(FJ627274)、YHV 1999(FJ848675)等 6株 YHV 一起首先從 GAV(NC_010306)和 YHV type4(EU170438)親緣關系中分離出來,位于一條主分支。但在這一主分支上,YHV_AHPNS_hb2012(KF278563)明顯與6株YHV表現出較遠的分離關系(圖3a)。

由第2步PCR產物序列構建的系統發育樹總體維持了上述關系,三地來源的YHV屬同一次分支,但在這3株之間,YHV_AHPNS_hb2012(KF278563)與YHV_AHPNS_fj2013(KF278564)親緣關系較近,而 YHV_AHPNS_gd2013(KF278565)又有較遠的延伸(圖3b)。

圖1 肝胰腺病理組織觀察Fig.1 Pathologic histology diagnosis in hepatopancreas

圖2 套式PCR檢測YHV結果Fig.2 Result of detecting YHV(yellow-head virus)by nested-PCR

表2 三地來源的YHV檢測產物序列與YHV1992、YHV1995對應序列的比對Tab.2 Alignment between the sequences of the products of YHV(yellow-head virus)detections and those of YHV1992 and YHV 1995

圖3 疑患AHPNS對蝦檢出的YHV陽性片段序列與YHV/GAV相應序列的系統發育樹Fig.3 Phylogenetic tree of the PCR products of the shrimp suspicious of suffering from AHPNS and the relevant sequences of YHV/GAV(gill-associated virus)

圖4 三地樣品YHV快速高靈敏度檢測試劑盒檢測結果Fig.4 Results of highly sensitive and rapid detection kit for YHV with the samples from three locations

2.5 三地樣品的快速高靈敏度檢測試劑盒檢測

三地樣品提取的RNA用YHV快速高靈敏度檢測試劑盒進行80min的LAMP反應檢測后顯色,陽性對照顏色顯示為強綠色,陰性對照顏色顯示為橙黃色,表明試劑盒檢測正常結果有效。三個地區取樣的樣品的 RNA經檢測,結果全部顯示強綠色,均為YHV強陽性。

3 討論

YHD是 OIE收錄的甲殼動物疫病,我國將其列為二類動物疫病。YHV基因型1是黃頭病毒群的已知 6個基因型之一,也是黃頭病的唯一病原(OIE,2012),GAV是黃頭病毒群的基因型2,GAV和其他4個基因型(基因型3—6)通常只在東非、亞洲和澳大利亞養殖的健康斑節對蝦中出現,很少與疫病相關(Walkeret al,2001;Wijegoonawardaneet al,2008;Wijegoonawardaneet al,2009)。經我們多年的流行病學監測,從未在我國養殖的對蝦中檢出過 YHV,從我國各地的水生動物流行病學監測數據中也從未發現我國有發生 YHD的情況,我國 2005年曾報道過YHV的檢出,該樣品是泰國入境的斑節對蝦(熊煒等,2006)。本文采用 OIE標準,從我國養殖對蝦中檢測到 YHV的陽性,是我國養殖的對蝦樣品中首次檢出YHV的存在。這一結果得到確認后,我們立即向農業部作了報告,隨后,我國于 2012年底向 OIE通報了該疫病在我國的存在。

2010年以來,新發生的 EMS/AHPNS給對蝦養殖業帶來了嚴重損失,在國際上引起了廣泛關注,雖然國際上對這一疫病的病癥和病理特征給出了明確的定義,但該疫病的病原病因一直沒有明確結論(Flegel,2012;Leanoet al,2012;Lightneret al,2012;NACA,2012),使疫病防控無從下手。本文觀察到的癥狀與NACA對AHPNS的癥狀定義相符,且組織病理學特征也符合 AHPNS的組織病理學定義(NACA,2012),表明這些對蝦確實罹患 AHPNS,在這些患病對蝦中均一致檢出我國從未檢出過的 YHV新毒株,即引起AHPNS的病原可能是這一新基因型的YHV。

國際上有觀點認為 AHPNS最早于2009年在中國南方發生(Flegel,2012;Leanoet al,2012)。我們在2009年的流行病學調查中采集到與AHPNS相似的凡納濱對蝦“偷死病”樣品,但對所采集的樣品的組織病理學與AHPNS病理學特征不符,其發病癥狀也有所差異,“偷死病”與AHPNS可能是2種不同病害(Huang,2012)。2010年越南對蝦養殖業遭受了 AHPNS的嚴重打擊,而我國當年對蝦養殖產量并沒有如越南那樣受到嚴重影響,目前并沒有確切的證據表明該病最早發生于我國。我國養殖對蝦在此之前從未檢出過YHV,該疫病病原得到確認以后,這一疫病的真正源頭也將有可能逐步得以揭示。

在AHPNS的病因分析中,國內外學者都進行了多種病原的篩查,白斑綜合征病毒(WSSV)等病原在很多檢測中都表現出與該疫病不相關(Flegel,2012;Huang,2012;Lightneret al.2012),雖然從患病對蝦中分離到了有致病力的副溶血弧菌(Vibrio parahaemolyticus)等細菌性病原(張寶存等,2012),但病理學和人工感染研究表明細菌的感染應該是繼發感染(Flegel,2012;Lightneret al,2012;NACA,2012),我們的前期調查和國外研究者也排除了YHV感染的可能(Flegel,2012;Huang,2012;NACA,2012)。但本文研究結果顯示,新檢測到的 YHV遺傳差異介于YHV致病1型與非致病4型之間,與已報道的YHV存在明顯的差異,所測的基因片段的相似性在 90%以下,且對蝦肝胰腺呈現與患AHPNS對蝦相似的病理。用OIE手冊的標準進行檢測時,只有河北來源的樣品在套式 RT-PCR的第 1步反應中得出目的產物,而福建和廣東樣品都只在套式的第2步擴增中得到微弱的產物條帶,基因序列分析表明樣品間存在明顯的YHV變異,這符合 RNA病毒變異的特點,可能也導致 OIE標準方法靈敏度低,甚至檢測不到,更多的序列分析和分子流行病學調查將最終揭示這個猜測。

YHV現場快速高靈敏檢測試劑盒利用等溫擴增檢測方法,實現了對特異性對蝦病毒病的快速、簡便、高特異性、高靈敏度的檢測,可應用于生產現場(張慶利等,2011)。試劑盒反應的綠色熒光的強弱對指示病毒量有一定參考價值,與 OIE標準方法的套式RT-PCR結果相比,對這一新的YHV毒株來說,快速高靈敏度檢測試劑盒更適應于靈敏地檢測,這對于在產業上更廣泛地確認 YHV新毒株是否是 AHPNS的病原有重要意義,也將為AHPNS的防控提供關鍵技術。

致謝感謝河北、福建、廣東相關單位及個人在本文樣品采集方面提供的便利。

張慶利,黃 倢,楊 冰等,2011.對蝦黃頭病毒現場快速高靈敏檢測試劑盒及檢測方法.P:ZL 201010147946.2,國家知識產權局,2011-07-01

張寶存,劉 飛,邊慧慧等,2012.一株凡納濱對蝦病原菌的分離、鑒定及其致病力分析.漁業科學進展,33(2):56—62

熊 煒,邱 璐,李 健等,2006.上海檢驗檢疫局從泰國進境草蝦中檢出蝦黃頭病毒.檢驗檢疫科學,16(6):61—63

Bell T A,Lightner D V,1988.A handbook of normal penaeid shrimp histology.Lawrence,Kansas

Chantanachookin C,Boonyaratpalin S,Kasornchandra Jet al,1993.Histology and ultrastructure reveal a new granulosislike virus inPenaeus monodonaffected by yellow-head disease.Dis Aquat Org,17(2):145—157

Cowley J A,Walker P J,Flegel T Wet al,2012.Family Roniviridae.In:Virus Taxonomy,IXth Report of the International Committee on Taxonomy of Viruses.King A,ed.Elsevier,Academic Press,London:797—801

Flegel T W,2012.Historic emergence,impact and current status of shrimp pathogens in Asia.J Invert Pathol,110(2):166—173

Huang J,2012.Experiences in EMS/AHPNS from China.In:Report of the Asia Pacific Emergency Regional Consultation on the Emerging Shrimp Disease:Early Mortality Syndrome(EMS)/ Acute Hepatopancreatic Necrosis Syndrome(AHPNS),9-10 Aug 2012.Published by the Network of Aquaculture Centres in Asia-Pacific,Bangkok,Thailand.2012:112—117

Leano E M,Mohan C V,2012.Early mortality syndrome threatens Asia’s shrimp farms.Global Aquaculture Advocate,July/August 2012:38—39

Lightner D V,Redman R M,Pantoja C Ret al,2012.Early mortality syndrome affects shrimp in Asia.Global Aquaculture Advocate,2012:40

NACA,2012.Report of the Asia Pacific emergency regional consultation on the emerging shrimp disease:early mortality syndrome(EMS)/ acute hepatopancreatic necrosis syndrome(AHPNS),9-10 Aug 2012.Published by the Network of Aquaculture Centres in Asia-Pacific,Bangkok,Thailand

OIE,2012.Manual of Diagnostic Tests for Aquatic Animals.World Organisation for Animal Health,http://www.oie.int/international-standard-setting/aquatic-manual/access-online/

Sittidilokratna N,Chotwiwatthanakun C,Wijegoonawardane P K Met al,2009.A virulent isolate of yellow head nidovirus contains a deformed envelope glycoprotein gp116.Virology,384(1):192—200

Walker P J,Cowley J A,Spann K Met al,2001.Yellow head complex viruses:Transmission cycles and topographical distribution in the Asia-Pacific Region.In:The New Wave,Proceedings of the Special Session on Sustainable Shrimp Culture,Aquaculture 2001,Browdy C.L.&Jory D.E.,ed.The World Aquaculture Society,Baton Rouge,LA,USA:292—302

Wijegoonawardane P K M,Cowley J A,Phan Tet al,2008.Genetic diversity in the yellow head nidovirus complex.Virology,380(2):213—225

Wijegoonawardane P K M,Cowley J A,Sittidilokratna Net al,2009.Homologous genetic recombination in the yellow head complex of nidoviruses infectingPenaeus monodonshrimp.Virology,390(1):79—88