寄生性病原血卵渦鞭蟲(Hematodinium sp.)感染山東半島養(yǎng)殖梭子蟹的初步研究*

李才文 宋書群 劉 云 王金鳳, 肖 潔

(1.中國科學院海洋研究所海洋生態(tài)與環(huán)境科學重點實驗室 青島 266071;2.中國科學院大學 北京 100049;3.國家海洋局第一海洋研究所 青島 266061)

Hematodinium是一類感染海水甲殼類的寄生性甲藻(parasitic dinoflagellates)(Stentifordet al,2005;李才文等,2013)。目前,該類寄生性病原已經在 20多種螃蟹、1種對蝦、1種龍蝦和10多種端足類動物中被報道發(fā)現(Shields,1994;許文軍等,2010;李才文等,2014),已先后在法國、英國、加拿大、澳大利亞和美國等國家近海海域大范圍流行,嚴重影響了挪威龍蝦(Nephrops norvegicus)、美國蘭蟹(Callinectes sapidus)、蛛雪蟹(Chionoecetes opilio)、白氏雪蟹(C.bairdi)等多種重要經濟甲殼類的漁業(yè)生產(Meyerset al,1987;Fieldet al,1992;Messicket al,2000;Stentifordet al,2002,2003,2005;Sheppardet al,2003)。

近年來,血卵渦鞭蟲(Hematodiniumsp.)先后在我國浙江舟山、寧波和臺州海域的海捕和養(yǎng)殖三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus)(許文軍等,2007a)、鋸緣青蟹(Scylla serrata)(許文軍等,2007b)、養(yǎng)殖脊尾白對蝦(Exopalaemon carinicauda)(Xuet al,2010)和廣東省汕頭海域低鹽養(yǎng)殖的鋸緣青蟹(Liet al,2008)中被發(fā)現和報道,并已確定該寄生性病原是近年來引起舟山群島海水養(yǎng)殖三疣梭子蟹大規(guī)模死亡“牛奶病”和青蟹“黃水病”的主要病原之一。三疣梭子蟹也是山東半島海水養(yǎng)殖的重要經濟物種,2009年山東半島養(yǎng)殖三疣梭子蟹產量達 3萬噸,約占全國總產量的三分之一(中國漁業(yè)年鑒,2010)。

雖然此前,山東半島尚未有寄生性病原Hematodinium感染三疣梭子蟹的報道,而自 2011年秋季起,山東省膠南市的三疣梭子蟹養(yǎng)殖區(qū)內發(fā)現個別養(yǎng)殖池的梭子蟹由于未知原因而大規(guī)模死亡。因此,我們在2012年 7—11月間,對于膠南市海州灣和煙臺市萊州灣的養(yǎng)殖和海捕梭子蟹進行了隨機取樣檢測,并進行了人工感染實驗。經病原、組織病理、電鏡觀察和分子生物學鑒定,我們在該區(qū)域首次發(fā)現了血卵渦鞭蟲(Hematodiniumsp.)感染;并且,該寄生性病原能夠感染健康梭子蟹并導致典型組織病理變化。進一步分析表明,在山東半島周邊海域發(fā)現的Hematodinium與在我國東南沿海一帶發(fā)現的Hematodinium有很近的遺傳關系。本研究顯示寄生性病原(Hematodiniumsp.)在我國沿海地區(qū)的重要經濟甲殼類中有廣泛的分布,考慮其對經濟甲殼類的危害,其傳播、發(fā)生機制應該引起足夠的重視。

1 材料和方法

1.1 材料來源

梭子蟹樣品(Portunus trituberculatus)于2012年7—11月間分別隨機采集自山東省膠南市海州灣和煙臺市萊州灣的養(yǎng)殖池中或者從水產市場上購買的源自鄰近海域的野生梭子蟹(圖1)。螃蟹均無明顯發(fā)病癥狀,個體體長13—16cm,體重108—220g。樣品置于低溫冷藏箱中及時運回實驗室,暫養(yǎng)于裝配循環(huán)水和充氣系統(tǒng)的玻璃缸中(溫度18—22°C,鹽度25—27),直至樣品處理或進一步實驗。

圖1 山東半島三疣梭子蟹取樣站點示意圖Fig.1 Sampling sites of Chinese swimming crab P.trituberculatus in Shandong Peninsula,China

1.2 血淋巴檢測

參照 Stentiford等(2005)的方法對螃蟹樣品寄生性病原Hematodinium的感染情況進行檢測。具體步驟如下:用一次性 1mL注射器(27號針頭)從第五步足與蟹體的軟組織結合處無菌抽取約 250μL血淋巴,滴～50μL在載波片上并與等體積的中性紅溶液(0.04%w/v,1×PBS)混勻,蓋上蓋波片于顯微鏡下觀察并拍照(Olympus BX53,DP73數碼鏡頭)。Hematodinium細胞能夠主動吸收中性紅,其溶酶體被染色而呈亮紅色;有些瀕死血淋巴細胞內的顆粒物有時也會被染成暗紅色,然而其染色顆粒大小顯著小于Hematodinium細胞內染色的溶酶體。剩余的血淋巴(～200μL)經 100% 酒精固定后于-20°C 保存用于DNA提取和分子生物學檢測。

1.3 感染實驗

共 12只經血淋巴檢測和 PCR檢測(方法見 1.4)診斷沒有Hematodinium感染的螃蟹暫養(yǎng)在兩個配有生物濾器和紫外消毒裝置的 300L玻璃缸中(鹽度 25—27,溫度 17—19°C),用于人工感染實驗。從感染Hematodinium的螃蟹中抽取血淋巴,通過顯微計數,估算血淋巴中Hematodinium細胞濃度,并用PBS緩沖液稀釋終濃度至約106cell/mL作為注射液;將受試螃蟹第五步足和蟹體軟組織結合處用酒精(70%)擦拭干凈,小心注入100μL注射液(大約105Hematodinium細胞)。實驗期間(共 10天),每天定時投喂蛤蜊肉一次,并觀測評估螃蟹生活狀況,及時取出瀕死螃蟹進行組織病理樣品采集(詳細步驟見1.5)。注射感染后第10天,存活的螃蟹經解剖、取樣處理后用于組織病理診斷(見 1.5)。

1.4 組織病理和電鏡檢測

解剖梭子蟹樣品,取肝胰腺、心臟、鰓絲、上皮組織和肌肉等組織塊于 10%海水福爾馬林固定,48h后轉移到 70%酒精中長期保存或進行下一步處理;參考Wheeler等(2007)的樣品處理和石蠟切片技術處理固定樣品,而后經系列脫水后進行 H&E(hematoxylin and eosin)染色,切片經蓋片、封片后于顯微鏡下觀察螃蟹組織病理變化并拍數碼照片。

從重度感染Hematodinium的螃蟹中抽取血淋巴,低速離心沉降(400r/min)棄上清液,加入 10倍體積2.5%戊二醛(0.1mol/L PBS,pH7.4)于冷藏條件下(4°C)固定24h以上,直至進一步樣品處理;另取小塊肝胰腺組織(0.5—1mm3),按類似方法固定處理。參考姜明等(1996)方法進一步處理固定樣品,經鋨酸固定,梯度乙醇脫水,Epon812包埋,超薄切片染色后,用日立 H-7000透射電鏡(中國海洋大學測試中心)觀察并攝影。

1.5 分子生物學檢測

按照E.Z.N.ATMTissue DNA kit(Omega Bio-Tek,USA)的說明書從酒精固定的血淋巴中提取樣品基因組DNA,分別采用針對HematodiniumrRNA基因間的內轉錄第1間隔區(qū)(internal transcribed spacer 1,ITS 1)的特異性引物(正向引物:5′GTTCCCCTTGAACG AGGAATTC 3′,反向引物:5′CGCATTTCGCTGCG TTCTTC 3′,Hudsonet al,1994)和針對小亞基(SSU)完整序列的特異性引物(正向引物:5′CTGCCAGTA GTCATATGC 3′;反向引物:5′CACGGTGAATGTTT GTGTGTGAA 3′,Smallet al,2012),在 Mastercycler?pro thermocycler PCR儀上(Eppendorf,Germany)進行擴增檢測樣品是否感染Hematodinium,并進一步分析其遺傳關系。PCR反應體系包括:1μL(10—50ng)DNA 模板,引物各 2μL(終濃度 2μmol/L),12.5μLPCR 混合液(Dongsheng Biotech,Guangzhou,China)和 7.5μL 超純去離子水,共 25μL。ITS 1 PCR反應條件如下:94°C 預變性 5min,94°C 變性30s→56°C退火 30s→72°C延伸 1min,35個循環(huán)后,再72°C延伸5min;SSU PCR反應條件如下:94°C預變性 5min,94°C 變性 1min→58°C 退火 1min→72°C延伸 1min,共 30個循環(huán)后,再 72°C延伸 5min。擴增產物經瓊脂糖凝膠電泳(1.5%w/v)、溴化乙啶(ethidium bromide)染色后于紫外燈下觀察并拍照(Tannon 3500凝膠成像系統(tǒng))。

1.6 分子測序和遺傳學分析

上述 PCR擴增產物(ITS 1和 SSU)經 TaKaRa MiniBest DNA 提純試劑盒(Ver.3.0)(TaKaRa,China)純化后,送上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司用上述特異性引物進行雙向測序。所得序列通過 BLAST(basic local alignment search tool)與NCBI(National Center for Biotechnology Information)GenBank中的相應序列進行比較分析,并選取代表性序列(序列號:DQ925231-925234,EF065714-065716,EF065718,EF-153724-153726,EF173451-173454,FJ844430-844431),運用 MacVector 12.6(MacVector Inc.,Carey,NC)的CLUSTALW 算法進行序列比對分析。并根據 Small等(2012)的分析結果,從核苷酸排列矩陣中,提取含有344bp的ITS-1序列,運用MEGA 5(Tamuraet al,2011)分析軟件進行遺傳相似性分析。

2 結果

2.1 血卵渦鞭蟲感染情況

經血淋巴和 PCR方法檢測,自山東省膠南市海州灣養(yǎng)殖區(qū)采集的20只養(yǎng)殖三疣梭子蟹中有三只確定為Hematodinium感染,其中兩只為重度、一只為中度感染;源于周邊海域的 20只野生三疣梭子蟹中則未發(fā)現感染。而在煙臺市萊州灣的養(yǎng)殖池中養(yǎng)殖區(qū)采集的 20只養(yǎng)殖三疣梭子蟹中,發(fā)現一只重度感染Hematodinium的三疣梭子蟹,從水產市場上購買的源自鄰近海域的 20只野生梭子蟹中也未發(fā)現Hematodinium感染。

在注射感染的 12只梭子蟹中,有兩只在注射后兩天內死亡,經血淋巴檢測和PCR檢測確認未發(fā)現Hematodinium感染,但發(fā)現體液中有大量細菌,這些梭子蟹可能是由于注射過程中細菌侵入宿主體內而導致死亡。到注射后第 8天開始有梭子蟹死于Hematodinium感染,實驗結束時共有 8只螃蟹確診被Hematodinium感染,存活率為33.3%(圖2)。

圖2 三疣梭子蟹人工感染Hematodinium sp.實驗結果Fig.2 Survival of Chinese swimming crab P.trituberculatus artificially infected with Hematodinium sp.

2.2 血卵渦鞭蟲的常見形態(tài)

本次調查中采集的梭子蟹,包括四只確認感染Hematodinium的梭子蟹,都沒有像其他宿主蟹蝦類感染Hematodinium后所表現的諸如體表暗淡或呈黃紅色等外部發(fā)病癥狀,只是感染Hematodinium的梭子蟹的血淋巴明顯稀薄而不能像健康梭子蟹的血淋巴一樣能夠瞬間凝固。在染病梭子蟹的血淋巴中共發(fā)現Hematodinium的四種生活史形態(tài):絲狀滋養(yǎng)體(filamentous trophont)、單細胞滋養(yǎng)體(uninucleate trophont)、滋養(yǎng)體聚合體(trophont clumps)和多核孢子體(multinucleate sporonts)(圖3)。Hematodinium不同生活史階段的大小差異很大,例如單細胞營養(yǎng)體的直徑范圍為 9—15μm,其大小與宿主的血細胞接近,而絲狀營養(yǎng)體和多核孢子體則是宿主血細胞大小的3—5倍以上。

圖3 感染Hematodinium sp.三疣梭子蟹的血淋巴中不同生活史階段的顯微形態(tài)Fig.3 Hematodinium parasites in hemolymph of diseased Chinese swimming crab P.trituberculatus

2.3 組織病理變化

Hematodinium感染導致梭子蟹肝胰腺、心臟、鰓絲、上皮組織等組織出現明顯病理變化,尤其是肝胰腺和心臟。重度Hematodinium感染的梭子蟹,其肝管結締組織間隙和血竇處內均充滿大量寄生蟲,肝小管有序的排列方式由于間隙寄生蟲的大量增殖、擠壓而改變,其上皮組織與結締組織間的清晰界限也由于病原的侵入而變模糊(圖4a)。感染Hematodinium梭子蟹的心肌也由于寄生蟲的增生、侵入而變形、斷裂,心肌層間的結締組織也空泡化甚至喪失,導致肌纖維原本密實的結構變得松散破碎(圖4b)。

圖4 感染血卵渦鞭蟲(Hematodinium sp.)三疣梭子蟹的組織病理變化Fig.4 Histopathology of Chinese swimming crab P.trituberculatus infected with Hematodinium sp

2.4 電鏡觀察

在山東半島梭子蟹養(yǎng)殖區(qū)發(fā)現的Hematodiniumsp.的超微結構與在浙江舟山群島發(fā)現的Hematodiniumsp.的超微結構類似。該寄生性病原的染色體呈濃縮狀態(tài)分布于細胞核內,形成甲藻類特有的間核結構;細胞質內也發(fā)現脂肪粒,線粒體等細胞器;囊泡膜結構(alveolar membrane)下面分散著不規(guī)則空泡結構。然而,我們并沒有在這種Hematodiniumsp.的電鏡觀察中發(fā)現模式種Hematodinium perezi所報道發(fā)現的刺絲泡(trichocyst)結構和頂復蟲門類(Apicomplexans)特有的微孔結構(micropores)(圖5)。

圖5 染病三疣梭子蟹血淋巴中Hematodinium sp.的超微結構Fig.5 General ultrastructure of Hematodinium cells in hemolymph of infected Chinese swimming crab P.trituberculatus.

2.5 分子生物學鑒定及遺傳學分析

本研究獲得的Hematodiniumsp.的 RNA小亞基(SSU)序列(～1750bp)與已發(fā)表的Hematodinium的相應序列完全一致(GenBank No.EF065718)。利用Hudson 等(1994)設計的特異性 PCR 引物,從感染Hematodiniumsp.的血淋巴樣品中擴增出約630bp的產物,該片段包含部分SSU序列,完整ITS 1區(qū)和部分5.8S序列,其中ITS 1區(qū)長度為344bp。通過ITS 1序列比對,在山東半島報道發(fā)現的Hematodiniumsp.有三種不同的基因類型,第一種在 88號位點有4堿基插入,第二種在145號位點有1個堿基插入,第三種在105號位點有堿基轉換(T→C)。與在浙江舟山海域發(fā)現報道的Hematodiniumsp.的相應序列(Genbank Nos.EF173451—173454)比較,第二、三種基因型此前已有報道,而第一種為新發(fā)現基因型,遺傳分析表明其與浙江海域發(fā)現的Hematodiniumsp.親緣關系較近(99%相似度);與在歐洲(GenBank Nos.EF065714—065716,EF153724—153726)和北美(GenBank Nos.DQ925231—925236,FJ844430—844431)報道發(fā)現的Hematodinium perezi的相應序列有95%的相似度。基于ITS 1序列的遺傳進化分析表明,在我國報道發(fā)現的Hematodiniumsp.在分子進化樹中組成單源支,與在歐洲和北美發(fā)現的Hematodinium perezi形成親緣關系密切的姊妹支(圖6)。

圖6 我國發(fā)現的寄生性病原Hematodinium與在歐洲和北美洲發(fā)現的Hematodinium種的遺傳關系分析Fig.6 Molecular phylogenetic anaylsis of Hematodinium sp.identified in China based on genetic distances analysis of the first internal transcribed spacer(ITS1)of rDNA

3 討論

寄生性病原血卵渦鞭蟲(Hematodiniumspp.)是近年來在世界范圍內危害經濟甲殼類的主要病原之一,其顯著影響與危害堪與對蝦科(Penaeidae)中流行的白斑綜合癥病毒病(white spot syndrome virus,WSSV)和龍蝦科(Palinuridae)中頻繁發(fā)病的高夫敗血癥(Gaffkemia disease)相提并論(Stentifordet al,2005);鑒于其對于經濟甲殼類的危害,Hematodinium也被認為是一類非典型有害藻華甲藻類(Burkholderet al,2006;Frischeret al,2006)。自2004年報道發(fā)現以來,該寄生性病原對我國東南沿海幾種主要養(yǎng)殖蟹蝦類的流行性發(fā)病逐漸引起研究者的重視;然而在北方蟹蝦類主要養(yǎng)殖區(qū)(包括山東省)此前尚未有關于該寄生性病原感染養(yǎng)殖蟹蝦的報道。本研究首次在山東半島發(fā)現了Hematodinium感染養(yǎng)殖梭子蟹,表明該寄生性病原在我國沿海地區(qū)有更廣的地理分布,其對我國沿海蝦蟹類養(yǎng)殖業(yè)的危害應得到充分的重視;并且為防止該類病原性病原的繼續(xù)擴散,其來源及傳播擴散方式等亟需進一步調查研究。

關于感染養(yǎng)殖蝦蟹的Hematodinium病原來源,是關系到如何防治該病害的關鍵性問題之一。2004年以來,該寄生性病原相繼在我國東南沿海的養(yǎng)殖梭子蟹和鋸緣青蟹中被報道發(fā)現(許文軍等,2007a,b;Liet al,2008),之后又在與梭子蟹混合養(yǎng)殖的脊尾白蝦中發(fā)現Hematodinium感染(Xuet al,2010),本研究又在我國北方梭子蟹養(yǎng)殖區(qū)發(fā)現了Hematodinium感染。Hematodinium的宿主種類繁多,其中流行病的發(fā)生主要集中于多種野生的短尾亞目甲殼動物(蟹類)和一種龍蝦,其它端足類宿主可能在傳播擴散的過程起中間宿主或攜帶者的作用(Stentifordet al,2005)。然而,目前尚缺乏我國沿海一帶野生蟹蝦類中Hematodinium感染率的調查研究。盡管我們在山東半島養(yǎng)殖區(qū)附近的野生梭子蟹進行了初步采樣檢測,可能受采樣季節(jié)、數量或采樣物種的影響,并沒有在養(yǎng)殖區(qū)附近的野生梭子蟹中發(fā)現Hematodinium感染。因此,感染這些養(yǎng)殖蝦蟹的Hematodinium來源還十分不清楚,有待于更進一步的詳細研究。

三疣梭子蟹養(yǎng)殖在我國沿海地區(qū)的水產養(yǎng)殖業(yè)中占有很大比重,據《2010中國漁業(yè)年鑒》統(tǒng)計其養(yǎng)殖規(guī)模在在2009年達到44萬畝,產量超過9.6萬噸。為了高效率的餌料利用和經濟產出,我國目前沿海大多數海水養(yǎng)殖區(qū)普遍采取多物種混合(polyculture system)或間期養(yǎng)殖(rotation culture)模式,例如蝦類和貝類、蝦類和魚類、貝類和海參等(Wanget al,2004)一起養(yǎng)殖;有些養(yǎng)殖區(qū)還采取了蟹類與蝦類的混合養(yǎng)殖模式,例如梭子蟹與脊尾白蝦或斑節(jié)對蝦等(浙江舟山、山東半島等地區(qū))。這種養(yǎng)殖模式對提高養(yǎng)殖水域的經濟效率起到了重要作用;然而,這種高密度混合養(yǎng)殖模式有可能增加一些流行性病原(病毒、細菌、寄生蟲等)在相近養(yǎng)殖物種之間的傳播機率,從而使病原在新的宿主中傳播擴散。例如,Xu等(2010)首次報道了我國浙江舟山養(yǎng)殖脊尾白蝦受Hematodinium的感染,而導致大面積死亡;分子生物學研究表明,感染脊尾白蝦的Hematodinium與同池混養(yǎng)的梭子蟹中的Hematodinium為同一種。目前缺乏對于流行性病原在這種養(yǎng)殖池中的傳播和擴散等方面的研究,對于Hematodinium如何侵染新的宿主,以及是否在混養(yǎng)池外流行等問題還不清楚。這種生活史階段或多宿主流行性病原可以在不同的養(yǎng)殖對象之間相互傳播、擴散,為我們如何在實際生產過程中實現健康養(yǎng)殖提出了新的挑戰(zhàn)。

寄生性病原血卵渦鞭蟲(Hematodiniumspp.)傳播擴散途徑的相關研究一定程度上受限于對其復雜生活史認識的不足。迄今為止,盡管在超過 30多種甲殼動物中發(fā)現報道了Hematodinium感染,但只有從挪威龍蝦和美國蘭蟹中分離出來的Hematodinium種有完整的生活史研究(Appletonet al,1998;Liet al,2011),包括典型種H.perezi在內的其它種都沒有生活史方面的系統(tǒng)研究。我國報道發(fā)現的Hematodiniumsp.也沒有系統(tǒng)研究,在此前的文獻報道中已經發(fā)現了孢子(dinospores),滋養(yǎng)體(trophonnts)和孢子體(sporonts)這幾個階段,然而并沒有發(fā)現絲狀滋養(yǎng)體(filamentous trophonts or plasmodia)這一階段(許文軍等,2007a,b;Liet al,2008;Xuet al,2010)。在我們取樣的一只輕度感染的梭子蟹的血淋巴中,發(fā)現了形態(tài)多變的絲狀滋養(yǎng)體階段。盡管多數Hematodiniumspp.的生活史都至少包括孢子、滋養(yǎng)體和孢子體這幾個階段,然而不同宿主發(fā)現的Hematodinium種的生活史多有不同(Newmanet al,1975;Appletonet al,1998;Liet al,2011)。因此,有必要對我國發(fā)現的這種Hematodiniumsp.的生活史開展進一步研究,并深入探討關鍵生活史階段在其傳播擴散過程中的作用。

目前正式命名的Hematodinium種只有兩種:典型種Hematodinium perezi和H ematodinium australis,在我國發(fā)現的Hematodiniumsp.等其他未命名物種暫以Hematodiniumsp.或Hematodinim-like sp.來表示。本文分子測序結果顯示,在山東半島發(fā)現的Hematodinium的RNA小亞基序列與Genbank中的相應序列完全一致,其ITS 1序列有少數堿基差異。基于ITS 1序列的遺傳關系分析顯示,雖然在我國發(fā)現的Hematodinium的不同株系的 ITS1序列略有不同,但這些序列都歸于同一基因型(Genotype II),并與在歐洲發(fā)現的基因型(Genotype I)和在北美洲發(fā)現的基因型(Genotype III)有較近的遺傳親緣關系,這些結果與 Small等(2012)建議的Hematodinium物種分類體系一致。然而,我國發(fā)現的這種Hematodinium的描述、正式命名及其與其他Hematodinium物種的遺傳關系,尚需要更多的形態(tài)學描述、超微結構分析和其他基因信息的遺傳學分析的支持才能最終確定。

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