黃花水龍化感物質對銅綠微囊藻生長及藻毒素產生和釋放的影響*

吳 湘 吳 昊 葉金云

(1.浙江省水生生物資源養護與開發技術研究重點實驗室 湖州師范學院生命科學學院 湖州 313000;2.湖州市環境保護監測中心站 湖州 313000)

由富營養化引起的水華作為一種全球性環境問題,近年來受到人們越來越多的關注(de Figueiredoet al,2004),利用水生植物產生的次生代謝物質(化感物質)控制藻類水華已成為水環境研究領域的前沿和熱點課題( 啟鮮 鳴等,2005;胡洪營等,2006)。這是一種高效、安全、簡便的生物抑藻技術,具有抑藻作用強、成本低、材料天然易得、無二次污染等優點。化感物質通常在自然條件下易降解,在生態系統中不會積累,對特定的藻類具有顯著的抑制作用。因此,從水生植物中提取化感物質施入水體進行藻類控制研究具有重要的環境和生態意義。

鑒于多數水華藻種均能產生一定量的藻毒素(Coddet al,2005),因此在利用水生植物化感物質進行藻類控制研究的過程中,化感物質的生態安全性即其對含毒藻種產生和釋放藻毒素的影響規律同樣值得研究和關注。根據Jones等(1994)的研究發現,在利用有機鰲合銅類的化學殺藻劑抑制銅綠微囊藻生長過程中,水體中的微囊藻毒素(MC-LR)含量明顯上升,維持14天后才因微生物的降解作用而被逐漸減低。因此,利用化學殺藻劑抑制產毒藻細胞生長極易產生水質安全隱患,而利用水生植物的化感物質進行藻類水華控制是否會引發同樣的安全問題也必須得到應有的重視和關注,但是目前相關方面的研究十分有限,仍有待系統、全面地研究。

本試驗的研究對象為經作者前期研究(吳湘等,2007)發現的高效脫氮除磷的水生浮葉植物黃花水龍(Jussiaea stipulaceaOhwi),它具有適應性強、生物量大、次生代謝物質豐富等特點,通過分離提取其中的化感物質進行藻類控制研究具有良好的應用前景。由于半數以上的水華藻種都能夠產生藻毒素,且銅綠微囊藻又是最為常見的水華優勢藻種(Chenet al,2004;王欣伊等,2005),因此本試驗選用銅綠微囊藻(FACHB-905)為受試藻類,以藍藻毒素中最為常見、毒性最大的微囊藻毒素(MC-LR)為代表。通過研究黃花水龍化感物質對銅綠微囊藻生長的抑制作用,確定其最佳抑藻濃度范圍,同時闡明黃花水龍化感物質對銅綠微囊藻藻細胞內外MC-LR產生或釋放的影響規律,從而為水生植物化感物質在實際抑藻應用時的有效量化及其生態安全性評價提供一定的科學借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

黃花水龍采自浙江省湖州市鄉村河道,采集時間為7月上旬,選取個體均勻、生長良好的植株,全株洗凈后于60°C烘箱干燥48h,備用。實驗所用銅綠微囊藻(FACHB-905)購自中國科學院水生生物研究所淡水藻種庫,實驗前使用BG-11培養基(李鋒民等,2007)預培養7—8d,使之處于對數生長期。

1.2 實驗設置與方法

1.2.1 黃花水龍化感物質的提取 稱取 20g黃花水龍干植物體(粉碎至50目),置于500mL錐形瓶中,加入400mL乙酸乙酯,超聲波常溫提取1h。提取結束后,用濾紙濾去提取液中的殘渣,并通過 0.22μm有機系濾膜除去顆粒物的干擾,之后利用旋轉蒸發(100r/min,65°C)除去溶劑,獲得浸膏并稱重,最后用二甲基亞砜(DMSO)進行定容溶解,使得最高濃度組DMSO濃度小于1%,此濃度對銅綠微囊藻生長無影響(洪喻等,2008)。濃縮液在無菌條件下,通過0.22μm 無菌有機系濾膜除去微生物,于 4°C冰箱保存備用。

1.2.2 黃花水龍化感物質的抑藻活性檢測及最佳抑藻濃度范圍的確定 采用培養液檢測法,通過搖瓶實驗對黃花水龍化感物質進行抑藻活性檢測,并確定其最佳抑藻濃度范圍。將總體積為 200mL的藻類培養混合液(含5mL處于對數生長期的藻種液、一定量的經121°C高溫滅菌30min的 BG-11培養液以及黃花水龍的化感物質)加入500mL錐形瓶中,其中黃花水龍化感物質設置為5個濃度梯度,分別為0、25、50、75、150mg/L,每個濃度設 3個平行。將上述混合培養液置于溫度25°C,相對濕度70%,光照強度 50μmol/(m2·s),光暗比 14h︰10h的人工氣候室中培養 16d,每天通過顯微鏡計數法測定藻細胞密度,平行計3次,結果取均值。最后采用概率單位法擬合計算黃花水龍化感物質的半效應質量濃度(EC50,7d),該數值越低,說明其抑藻效果越好。

1.2.3 黃花水龍化感物質對MC-LR產生和釋放的影響測定 在 1.2.2實驗的基礎上,分別測定培養對數期(7d)和穩定期(16d)時胞外培養液和藻細胞中的MC-LR含量以及藻細胞密度。采用固相萃取(SPE)聯合高效液相色譜(HPLC)法測定微囊藻毒素MC- LR的含量。在進行MC-LR的HPLC測定前,先將待測的銅綠微囊藻培養液參照宋立榮等(1999)方法進行預處理。

1.3 數據處理方法

根據藻密度計算黃花水龍化感物質對藻細胞的相對抑制率:

其中IR為相對抑制率,N為加入化感物質組的藻密度(ind./mL),N0為對照組的藻密度(ind./mL)。采用概率單位法擬合計算EC50,7d。所有樣品平行測定3次,實驗結果取其均值。利用Excel進行數據分析和繪圖。

2 結果與討論

2.1 黃花水龍化感物質對銅綠微囊藻(FACHB-905)的生長抑制作用及其最佳抑藻濃度范圍的確定

黃花水龍化感物質以不同濃度梯度(0、25、50、75、150mg/L)分別投放到定量的銅綠微囊藻培養液中,同時進行抑藻效果測定。圖1分別對應各濃度組每天的藻密度變化及其相對抑制率(IR)。根據圖1a,在7d的培養期內,化感物質對銅綠微囊藻的生長抑制作用隨著化感物質濃度的增加而逐漸增強。采用概率單位法擬合計算求得黃花水龍化感物質的 EC50,7d值為47mg/L,說明黃花水龍化感物質對銅綠微囊藻生長具有較強的抑制作用。但在培養后期,各濃度組的抑制率均呈下降趨勢,說明化感物質對藻細胞的生長抑制作用會隨著時間延長而逐漸減弱。這可能與化感物質中有效抑藻成分存在降解或轉化作用(洪喻等,2009)有關,具體機理有待進一步探討。

圖1b的結果表明,不同濃度組的黃花水龍化感物質對銅綠微囊藻生長的影響作用也不同。其中對照組(0mg/L)隨著時間延長藻細胞數目迅速增加(圖1a);低濃度組(25mg/L)的化感物質在試驗開始1—2d內對藻細胞生長反而起促進作用,IR在-6.7%—5.2%之間,3d后才逐漸表現出對藻細胞生長的抑制作用,但是IR始終低于25%,抑藻效果較差。整個培養期內,除低濃度組外,其余濃度組對銅綠微囊藻均呈現出較顯著的生長抑制作用,這種低劑量促進、高劑量抑制和先促進后抑制的趨勢,之前已有相關文獻報道(何池全等,1999;劉光濤等,2011)。

圖1 不同濃度的黃花水龍化感物質對銅綠微囊藻藻密度(a)和相對抑制率(b)的影響Fig.1 Influence of different concentrations of J.stipulacea allelochemicals on the algae density(a),the inhibition ratio(b)of M.aeruginosa

中濃度組(50mg/L)的黃花水龍化感物質在藻細胞培養4d時對藻細胞的IR就已達到60%,但是培養后期IR下降較快,藻細胞生長恢復明顯。Nakai等(1999)研究發現,在一次性投加大型植物浸提液抑制銅綠微囊藻生長時,藻細胞在培養8d后即開始恢復生長,抑藻作用明顯減弱,這與本研究得到的結果類似。而較高濃度組(75mg/L)和高濃度組(150mg/L)的黃花水龍化感物質對銅綠微囊藻的生長抑制變化趨勢相類似,藻細胞培養3d時IR都已大于85%,培養后期IR雖有下降,但是較其他濃度組緩慢,化感物質仍發揮較好的抑藻作用。由此可知,雖然濃度越高對藻細胞生長的抑制作用越顯著,但是當濃度達到一定值時,濃度增加對提高IR影響不大,75mg/L和150mg/L的抑藻效果差異不顯著,出現了閾值效應,因此從節約原材料的角度考慮,75mg/L即可達到最好的抑藻效果。

綜上所述,黃花水龍化感物質的最佳抑藻濃度范圍應為 50—75mg/L,銅綠微囊藻在培養 4—7d內其相對抑制率可達50%—95%。化感物質之所以能夠抑制藻細胞生長,估計與其能提高藻細胞的呼吸速率,降低光合作用速率,降低葉綠素a含量有關( 啟鮮鳴等,2005)。同時根據李鋒民等(2007)的研究報道,化感物質在較低濃度時可以提高銅綠微囊藻的過氧化物酶、超氧化物歧化酶和脫氫酶的活性,而高濃度的化感物質則顯著降低了這些酶的活性。抑制銅綠微囊藻的抗氧化酶體系并促進藻類葉綠素的降解可能是化感物質的抑藻機理之一(Qianet al,2009)。本實驗同樣發現,隨著黃花水龍化感物質濃度的增加,且達到一定濃度范圍后,銅綠微囊藻單位藻細胞的葉綠素a含量迅速減少,與藻密度的變化趨勢一致,而葉綠素a含量與光合作用有關,從另一角度間接反映了化感物質的投加可以抑制藻類的光合作用,且化感物質濃度的高低與其抑藻活性顯著相關。

2.2 黃花水龍化感物質對銅綠微囊藻(FACHB-905)MC-LR產生和釋放的影響

2.2.1 黃花水龍化感物質對MC-LR釋放的影響 投加黃花水龍化感物質7d后胞外培養液中MC-LR的濃度參見表1,而16d后培養液中的MC-LR濃度均未被檢出,因此未列入表1。從表1可以看出,不論是對照組(0mg/L),還是其他濃度組(25—150mg/L),7d時胞外培養液中 MC-LR濃度都很低,小于 WHO推薦的飲用水體中MC-LR的最高限值1μg/L(Coddet al,2005);而藻細胞在培養 16d后開始進入生長穩定期,胞外培養液中MC-LR濃度均低于檢測下限。這說明,在本試驗16d的培養期內,黃花水龍化感物質的投加對銅綠微囊藻MC-LR的釋放無顯著影響。即使黃花水龍化感物質的濃度達到最大值150mg/L時,整個培養期內藻細胞向胞外釋放的藻毒素的量還是很少,有時甚至無法檢出。

表1 投加黃花水龍化感物質7d后胞外MC-LR的濃度Tab.1 Concentrations of extracellular MC-LR after adding J.stipulacea allelochemicals for 7 days

Robilllot等(2000)研究認為,無任何外界干擾情況下的藻細胞在培養前期胞外藻毒素濃度很低,可以忽略;進入穩定期前胞外藻毒素濃度都會維持在較低水平。本試驗在藻細胞培養16d時即進入穩定期,對照組依然未能檢測出胞外 MC-LR,意味著藻類在正常環境下向周圍水體釋放藻毒素的量并不多,而之所以目前存在許多藻毒素污染水體的問題,主要原因還是人們在施加化學殺藻劑時,引起死亡藻細胞內藻毒素的大量釋放。有研究發現,當使用硫酸銅化學殺藻劑處理銅綠微囊藻水華時,水體中的 MCLR(即胞外 MC-LR)含量明顯升高,嚴重威脅水域生態安全(Joneset al,1994)。而在本試驗中,黃花水龍化感物質既能有效抑制銅綠微囊藻的生長,又不會引起藻細胞的胞內藻毒素向外釋放,生態安全性高,因此可將黃花水龍化感物質應用至實際水華水體的處理中。

2.2.2 黃花水龍化感物質對MC-LR產生的影響 根據圖2a,對照組(0mg/L)的單位藻細胞 MC-LR含量(用 106單位個數藻細胞內 MC-LR的質量來表示)與Wiedner等(2003)的測定結果在同一水平。培養7d后,隨著黃花水龍化感物質濃度的增加,銅綠微囊藻培養液中單位藻細胞 MC-LR含量也隨之增加,當化感物質濃度為50—150mg/L時,單位藻細胞MC-LR含量顯著升高。

圖2 不同濃度的黃花水龍化感物質對銅綠微囊藻的胞內MC-LR含量(a)、MC-LR產生總量(b)的影響Fig.2 Influence of different concentrations of J.stipulacea allelochemicals on the intracellular MC-LR(a)and total MC-LR(b)contents in M.aeruginosa

培養7d后,除低濃度組外,黃花水龍化感物質對銅綠微囊藻產生了較強的化感抑制作用,藻細胞生長速率明顯減緩,藻密度一直維持在較低水平,且胞內MC-LR含量顯著升高。由此可知,為了抵御化感物質產生的脅迫作用,存活下來的藻細胞會合成更多的藻毒素(Janget al,2003)。Kearns等(2000)研究認為,藻細胞的內部能量一方面用于合成自身生長所需的營養物質,另一方面還可用于抵御外界環境脅迫的影響,例如銅綠微囊藻藻細胞在化感物質的作用下會將更多的能量用于藻毒素的合成,從而導致自身生長速率變緩。

培養16d后,黃花水龍化感物質對銅綠微囊藻的生長抑制作用減弱,藻細胞開始恢復生長,此時單位藻細胞中MC-LR含量的變化受化感物質濃度的影響不顯著。因此可以認為,培養16d后,黃花水龍化感物質對培養液中銅綠微囊藻胞內MC-LR產生的促進作用減弱,基本恢復到對照組水平。這可能與之前討論中提到的化感物質存在天然降解和轉化作用有關。

根據表1所示,銅綠微囊藻在整個試驗期內向胞外釋放的MC-LR含量極少,因此可不計入藻細胞MC-LR產生總量的計算中。單位藻細胞內MC-LR含量與相應藻密度的乘積即可作為MC-LR產生總量的結果。圖2b的結果表明,隨著黃花水龍化感物質濃度的增加,培養7d后藻細胞MC-LR產生總量逐漸降低,這可能是由于隨著化感物質濃度的增加,雖然單位藻細胞內MC-LR的含量會有所升高,但是同時藻密度也在迅速降低,因而使得兩者結合產生的MC-LR總量依然呈現下降趨勢,可見影響MC-LR產生總量的主要因子應為藻密度測定值。培養16d后,除最高濃度組外,培養液中MC-LR的產生總量隨化感物質濃度的增加變化不顯著,和圖2a反映的結果一致。150mg/L處理組在培養7d、16d時MC-LR產生總量都是所有濃度處理組中最低的,這可能是因為化感物質濃度越大,有效抑藻成分含量越多,即使到了16d,剩余的有效抑藻成分依然較其他濃度組多,對藻細胞生長還能發揮一定的抑制作用,從而使得MC-LR產生總量較其他濃度組要低。因此,在本實驗投加黃花水龍化感物質抑制銅綠微囊藻生長過程中,隨著化感物質濃度增加,不會使培養液中MC-LR產生的總量增大。

3 結論

(1)黃花水龍化感物質對銅綠微囊藻(FACHB-905)具有較強的生長抑制作用,EC50,7d值為47mg/L。培養1周內,隨著黃花水龍化感物質濃度的增加,其抑藻效果逐漸增強,但是隨著時間延長其抑藻效果也會逐漸減弱。黃花水龍化感物質的最佳抑藻濃度范圍應為 50—75mg/L,在此濃度下培養 4—7d對銅綠微囊藻生長的相對抑制率可達50%—95%。此濃度范圍可作為黃花水龍化感物質實際抑藻應用時一個有效劑量的參考值。

(2)整個培養期間,黃花水龍化感物質對銅綠微囊藻MC-LR的胞外釋放無顯著影響。培養7d后,單位藻細胞內 MC-LR的含量隨化感物質濃度的增加而升高,16d后無顯著影響。由此可知,黃花水龍化感物質既能有效抑制銅綠微囊藻的生長,又不會引起藻毒素的向外釋放,生態安全性高,可應用至實際水體處理中。

致謝衷心感謝中國科學院水生生物研究所、湖州市環境保護監測中心站在提供銅綠微囊藻藻種(FACHB-905),以及微囊藻毒素(MC-LR)測定方面提供的一切指導與幫助！

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