大菱鲆胃質子泵(H+ /K+ ATPase)與消化機能發生的關系*

遲 良 徐世宏 肖志忠 馬道遠 林 帆 趙春彥肖永雙 武寧寧 劉清華① 李 軍①

(1.中國科學院海洋研究所生物技術中心 青島 266071;2.中國科學院大學 北京 100049;3.青島市漁業技術推廣站 青島 266071)

胃質子泵,又稱為胃 H+/K+ATP酶(H+/K+ATPase),是胃酸分泌的關鍵性酶,它通過水解 ATP酶為離子轉運提供能量,完成 H+、K+離子轉運和胃酸的分泌(Chowet al,1995)。H+/K+ATPase首先在上世紀70年代,由Forte等人在牛蛙的胃粘膜分離出來(Prinzet al,1992)。后來證明H+/K+ATPase具有跨膜運輸質子的作用,從而為胃酸分泌機理的研究奠定了基礎(vanDrielet al,1995;Forteet al,1996)。

質子泵分為 α、β兩個亞單位。α亞基在胞質內外形成多個回褶,因此形成了胞質區、膜區和胞質外區三個功能區域。α亞基含有ATP結合位點、酰基磷酸化位點等,是質子泵的催化亞基,起催化和轉運H+、K+的功能(Kakeiet al,1995;Asanoet al,1997;Besanconet al,1997)。β亞基只含有一個跨膜區域,是質子泵的輔助亞基,主要起穩定α亞基和輔助泌酸的功能(Horisbergeret al,1991;Tyagarajanet al,1996;CourtoisCoutryet al,1997)。另外,研究表明 H+/K+ATPase的正常分泌對于維持壁細胞的結構和發育也起到重要的作用。Spicer等通過基因打靶技術培養的H+/K+ATPase α亞基缺失的小鼠出現胃酸分泌減少,胃粘膜細胞變形,微絨毛和管泡消失,線粒體異常等癥狀(Spicer et al,2000)。Scarff等發現 H+/K+ATPase β亞基缺失的小鼠會出現胃酸分泌減少,微管和管泡的結構紊亂等特征(Scarffet al,1999)。

目前,對于 H+/K+ATPase的研究主要集中在哺乳動物中,在海水魚類中關于 H+/K+ATPase還比較少。因為魚類在消化過程中會受到溫度,酸堿度及海水不斷稀釋、中和的影響,所以海水魚類的消化過程較陸生動物更為復雜。因此,研究H+/K+ATPase對了解海水魚類的消化機制重要的意義。

大菱鲆(Scophthalmus maximus)屬鲆科(Bothidae)、菱鲆屬(Scophthalmus),自然分布于東北大西洋沿岸,因其肉質鮮美,營養豐富,適應水溫低,現在已成為我國北方重要的海水養殖種類。研究大菱鲆的消化機制對優化餌料結構,合理投餌,提高苗種成活率都具有重要的意義。因此,本文以大菱鲆為材料研究H+/K+ATPase的時空表達模式及其與消化機能發生的關系,以期為研究大菱鲆乃至海水魚類的消化機理提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗所用大菱鲆魚苗及成魚取自山東煙臺東方海洋科技股份有限公司。采用腹部擠壓法獲得若干親魚成熟的卵子和精液,并采用人工受精獲得受精卵。將質量較好的浮性卵移入孵化網箱中進行孵化,孵化時水溫為(14 ± 0.5) °C。將初孵化仔魚轉至水泥池中培育,水泥池面積 25m2培養密度 125尾每升。培育條件:水溫調整為18—19 °C,溶氧7.0—8.5 mg/L,鹽度30—32,pH 7.7—8.0。4至19日齡,仔魚投喂輪蟲(Brachionus plicatilis)13至 35日齡,投喂鹵蟲(Artemianauplii)。從27日齡起開始投喂配合餌料。

分別取個時期胚胎(2細胞期,8細胞期,囊胚期,原腸期,心跳期)及仔稚幼魚(初孵為仔魚,鱗片出現為稚魚,鱗片鋪滿全身為幼魚),孵化后在每天投喂前取樣,分兩批分別投入液氮及 Bouin’s液中固定保存,分別用于RNA提取和組織切片研究。另外,取1齡成魚的腮、心臟、食管、胃、腸、肝臟、脾、腎、肌肉、卵巢等組織保存于液氮中,用于提取RNA。用于原位雜交實驗的仔稚魚每天投喂前取樣,4%多聚甲醛固定 24h,梯度甲醇脫水,置于 100%甲醇中–20°C 長期保存。

1.2 RNA的提取和cNDA第一鏈的合成

胚胎、仔稚幼魚及不同組織的樣品約100 mg,使用購于 BioFlux 公司的 Simply P Total RNA Extration Kit試劑盒提取總RNA。提取的總RNA經分光光度計檢測及甲醛變性電泳檢測后,使用北京全式金生物技術有限公司生產的 Transcript Fist-Strand Cdna Synthesis Supermix試劑盒反轉錄合成cDNA第一鏈。

1.3 大菱鲆H+/K+ ATPase α亞基cDNA全長的克隆

根據GenBank中已公布的H+/K+ATPase α亞基的基因序列,通過比對在保守區域設計引物HK1F和HK1R(表1),使用TransTaq HiFi DNA聚合酶(全式金北京)擴增大菱鲆H+/K+ATPase α亞基的保守片段。反應體系:0.25 μL TransTaq HiFi DNA Polymerase,5 mM dNTPs,上下游引物分別為 0.2μL,2.5 μL 10 ×TransTaqHiFi Buffer,2μL cDNA 模版 和 17.25 μL ddH2O補至25μL。PCR反應條件:94°C預變性5min;94°C 30s,54 30s,72°C 90s,30 個循環,最后 72°C 延伸8 min。對擴增產物使用凝膠回收試劑盒進行回收,將回收的PCR產物與pMT-18T連接后,轉化大腸桿菌E.coliDH5α中,然后送至北京華大基因公司進行測序。根據測序結果設計大菱鲆H+/K+ATPase α亞基RACE 引物 GSP1(3’RACE)和 GSP2(5’RACE)。

表1 試驗中所需的引物序列Tab.1 Primers used for gene amplification by PCR

RACE反應過程使用 SMARTTMRACE cDNA Amplication Kit(Clontech)進行,根據說明書要求進操作。RACE PCR 反應體系:5 mM dNTPs,2.5 μL 10×Universal Primer A Mix(UPM),5μM Gene Specific Primer,1.25 μL RACE-ready cDNA,0.5 μL HiFi TransTaq,2.5 μL 10 ×TransTaqHiFi Buffer,加水至25 μL。RACE 反應條件:94°C 預變性 5min,94°C 30s,68°C 45s,72°C 90s,最后 72°C 延伸 5min,36 個循環。PCR 產物經1%的瓊脂糖檢測后,使用瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收,連接至pMT-18T載體后,轉化大腸桿菌E.coliDH5α中,LB培養基培養過夜后,挑選陽性克隆送至上海美吉生物醫藥科技有限公司測序。

1.4 大菱鲆H+/K+ ATPase α亞基的表達模式分析

根據已獲得的大菱鲆 H+/K+ATPase α亞基的cDNA全長序列設計引物HK2F和HK2R和一對特異的內參引物β-actinF和β-actinR進行RT-PCR檢測大菱鲆H+/K+ATPase的時空表達情況。分別提取大菱鲆胚胎、仔稚幼魚及成魚鰓、食管、心臟、肝、脾、胃、腸、腎、肌肉和卵巢10個組織的總RNA,經反轉錄后用于 RT-PCR檢測和熒光定量 PCR檢測,定量檢測引物為HK3F和HK3R。 RT-PCR的總反應體系為 25 μL,其中 ddH2O 15.25 μL,10×PCR buffer 2.5 μL,dNTPs 4 μL,上、下游引物(10 μmol/L)各 1 μL,Taq 酶 0.25 μL,cDNA 模板 1 μL。反應條件為 4°C 預變性 5 min;94°C 變性 40 s、60°C 退火 30 s、72°C延伸2 min,26個循環。熒光定量反應體系為25 μL,SYBR Primix Ex TaqTMII(2×),12.5 μL,上下游引物(10 μmol/L)分別為 1 μL,cDNA 模版 2 μL,ddH2O,8.5 μL。反應條件為:95°C 30 s;95°C 5 s;60°C 30 s,40 個循環。

1.5 整體原位雜交

根據已獲得的大菱鲆 H+/K+ATPase α亞基的序列設計特異性地高辛標記的反義探針(上游:5’AGTGATGAGTTGGATGACGCAC 3’;下游:5’ ATA AGCCAGAGAAACAGAGGGG 3)進行整體原位雜交。探針的制備使用Roche探針標記試劑盒完成。按照其說明書操作。取4%多聚甲醛固定的22日齡的大菱鲆幼魚,經梯度甲醇脫水。將幼魚的內臟團剝離,梯度甲醇復水。10 μg/ml蛋白酶K進行消化2h,4%多聚甲醛在固定20 min。移去固定液,1×PBST清洗6次,每次10 min。然后預雜交液中60°C預雜交2h,在含有10ng/μL探針的雜交液中60°C雜交過夜。多余的探針經 50% SSCT/50%甲酰胺、2×SSCT、0.2×SSCT洗滌后,使用2%的脫脂奶粉封閉2h。經染色緩沖液平衡后,與抗體雜交4°C過夜。實驗結果使用Nikon YS-100顯微鏡觀察拍片記錄。

1.6 組織學觀察

大菱鲆幼魚Bouin’s液固定24h,70%乙醇保存。切片時使用乙醇梯度脫水,二甲苯透明,石蠟包埋進行連續切片,切片厚度 8μm,HE染色,在 Nikon YS-100顯微鏡下觀察拍片記錄。

1.7 序列分析和數據統計分析

測序結果使用DNASTAR Lasergene v7和MEGA 4.0進行結構和進化樹分析。利用SPSS13.0軟件對熒光定量PCR結果進行顯著性檢驗,P＜ 0.05表示具有顯著性差異,描述性統計量用平均值±標準差表示。

2 結果

2.1 大菱鲆H+/K+ ATPase α亞基cDNA全長序列分析

大菱鲆H+/K+ATPase α亞基cDNA 全長3467bp ,包含 5’UTR 175 bp,3’UTR 329 bp 和 ORF 2964 bp,編碼988個氨基酸,前30個氨基酸為信號肽(圖1)。通過與GenBank 上已公布的H+/K+ATPase α亞基比對發現大菱鲆 H+/K+ATPase 亞基與斑鱖(Siniperca chautsi) H+/K+ATPase α亞基序列同源性最高,達89%。

大菱鲆H+/K+ATPase α亞基蛋白序列具有10個跨膜結構域,蛋白磷酸化位點DKTGTLT(圖1)

2.2 大菱鲆H+/K+ ATPase α亞基的序列比對及進化樹構建

根據大菱鲆H+/K+ATPase α亞基的氨基酸序列,與GenBank公布的H+/K+ATPase α亞基氨基酸序列,使用MEGA4.0構建了大菱鲆H+/K+ATPase與其它物種的 Neighbor-joining系統進化樹(圖2),結果表明:H+/K+ATPase 的進化關系具有物種特異性,哺乳動物、禽類、兩棲類及魚類分別聚為一類。

2.3 大菱鲆H+/K+ ATPase在大菱鲆發育不同時期表達分析

以大菱鲆β-actin基因為內參基因,檢測了大菱鲆 H+/K+ATPase基因在仔稚幼魚不同發育時期及各組織的表達情況。結果顯示,大菱鲆H+/K+ATPase直至孵化后22d 才開始表達(圖3a)。熒光定量結果顯示,大菱鲆H+/K+ATPase基因的表達在呈現指數性的增長(圖3b )。另外,通過整體原位雜交技術顯示大菱鲆的H+/K+ATPase首先在消化道的食道和胃的賁門區開始表達,然后再逐漸擴散到整個胃區(圖3c)。

圖1 大菱鲆H+/K+ ATPase α亞基cDNA 及其氨基酸序列Fig.1 cDNA sequence and deduced amino acid sequence of H+/K+ ATPase α subunit gene from turbot(Scophthalmus maximus)

圖2 利用MEGA 4.0 構建的H+/K+ ATPase的NJ進化樹Fig.2 The Neighbor-joining tree of H+/K+ ATPase using MEGA 4.0

同時通過檢測RT-PCR及熒光定量PCR檢測大菱鲆成魚各組織 H+/K+ATPase的表達情況,結果顯示:大菱鲆 H+/K+ATPase主要在食道和胃中表達,在卵巢中也檢測到了H+/K+ATPase的微量表達(圖4a,圖4b)。

2.4 大菱鲆消化道的發育過程

為了能夠更好地了解大菱鲆的消化機理,作者對大菱鲆仔魚消化道進行了組織切片觀察,結果發現胚胎孵化后第一天(1 day post hatching,1 dph)大菱鲆的食管為一條細長的管狀。2 dph時,食道粘膜上皮由單層立方上皮細胞組成,3dph由單層立方上皮細胞變為復層扁平上皮,8 dph 出現杯狀細胞(圖5a—c)。

圖3 a 大菱鲆H+/K+ ATPase在發育不同時期的mRNA表達Fig.3a Expression of H+/K+ ATPase of development stages by RT-PCR

圖3 b 大菱鲆H+/K+ ATPase在發育不同時期的mRNA的定量分析Fig.3b Expression of H+/K+ ATPase of development stages by quantitative real-time PCR

圖3 c H+/K+ ATPase mRNA在大菱鲆消化道中的分布Fig.3c Development and distribution of H+/K+ ATPase mRNA in turbot digestive tract by whole in situ hybridization of antisense probe

圖4 a H+/K+ ATPase在大菱鲆不同組織的表達情況Fig.4a Expression of H+/K+ ATPase mRNA in tissues of adult turbot.M:Maker

圖4 b H+/K+ ATPase 在大菱鲆不同組織的相對表達量Fig.4b The relative expression in different tissues of H+/K+ATPase from turbot

大菱鲆胃的發育較食管的分化稍晚,初孵仔魚的胃沒有分化。2 dph,胃原基開始膨大,食管在接近胃體處的復層扁平上皮逐漸轉變為單層柱狀上皮。3 dph,胃粘膜逐漸出現褶皺,胃與食管的分化明顯。8 dph可分化為賁門區、基底區和幽門區(圖5d—f )。16 dph 胃腺出現。通過組織切片觀察證明,大菱鲆的胃是由食道的末端膨大分化而來的。

3 討論

α亞基含有ATP結合位點、酰基化位點和離子識別位點等,在穩定H+/K+ATPase酶的結構,行使功能等方面起到重要的作用(Besanconet al,1997;Asanoet al,1998)。因此本研究使用RACE技術克隆了大菱鲆的H+/K+ATPase α亞基,全長3467 bp,與GenBank已公布的H+/K+ATPase α亞基序列比對發現,與斑鱖的同源性最高達89%,其次與牙鯛(Diplodus sargus)、美洲鰈(Pleuronectes americanus)分別為88%和87%。通過進化樹分析發現H+/K+ATPase 在進化上具有物種特異性,哺乳類、鳥類、兩棲類和魚類分別聚為一類,作者認為這可能與物種的食物來源相關。

胃腺的出現通常是認為胃的功能完善的標志(Infanteet al,2001;Wuet al,2009)。H+/K+ATPase 動物體內主要起到提供酸性環境激活胃蛋白酶的作用,因此總是與胃的消化功能聯系在一起(Kageyama,2002)。作者通過 RT-PCR技術檢測到大菱鲆 H+/K+ATPase在胚胎孵化后 22d開始表達,結合作者關于大菱鲆胃蛋白酶原的實驗,作者認為大菱鲆的胃行使酸性消化功能至少要在 22d胃蛋白酶原與 H+/K+ATPase基因開始表達之后,因此胃的消化功能的完善未必與胃的組織結構完善一致。

圖5 大菱鲆食道和胃的組織發育Fig.5 Development of esophagus and stomach in turbot

H+/K+ATPase 主要在生物體胃中起到提供酸性環境輔助消化的作用(Scarffet al,1999;Spiceret al,2000)。但在其它的組織中H+/K+ATPase也具有其它的輔助功能。Altman等報道了H+/K+ATPase在有胃病的病人的喉部和下頜腺中會起到保護粘膜的作用(Altmanet al,2011)。Kraut 等研究發現在大鼠的腎臟也有 H+/K+ATPase的 mRNA表達,他們認為 H+/K+ATPase 在腎臟中能夠起到平衡體液中的離子和酸堿平衡的作用(Krautet al,1994,1997,2001)。Choe 等在黃貂魚(Dasyatis sabina)的鰓中檢測到了 H+/K+ATPase的表達,他們認為鰓中的H+/K+ATPase能夠讓黃貂魚更加適應海水的環境(Choeet al,2004)。在本研究中,通過RT-PCR和熒光定量PCR檢測,大菱鲆的 H+/K+ATPase不僅在胃中表達,在食道中的表達量也很高,另外在卵巢中也檢測到 H+/K+ATPase的微量表達。為了研究食道中有H+/K+ATPase的表達的原因,作者使用組織學技術,對大菱鲆的消化道的發育過程進行了研究。結果發現,大菱鲆的食道是胃的前體,胃的發育是在食道的末端由食道復扁平上皮轉化為柱狀上皮發育而來。因此作者認為,H+/K+ATPase在大菱鲆的食道中的高度表達可能是因為食道是胃的前體因此保留了分泌H+/K+ATPase的能力。另外,通過整體原位雜交實驗也證明大菱鲆的 H+/K+ATPase首先在胃的賁門部和食管的末端開始表達。這也從另一個方面證明了作者的觀點。

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