微型絲網印刷電極快速檢測克侖特羅的方法

梁 樺，宋 偉，許丹科，劉 英，鐘文英,*

（1.中國藥科大學理學院，江蘇 南京 211198；2.南京大學化學化工學院，江蘇 南京 210093；3.南京祥中生物科技有限公司，江蘇 南京 210022）

微型絲網印刷電極快速檢測克侖特羅的方法

梁 樺1，宋 偉2，許丹科2，劉 英3，鐘文英1,*

（1.中國藥科大學理學院，江蘇 南京 211198；2.南京大學化學化工學院，江蘇 南京 210093；3.南京祥中生物科技有限公司，江蘇 南京 210022）

研制能用于96孔酶標板快速檢測的微型絲網印刷電極，并建立克侖特羅的電化學分析方法。通過間接競爭免疫反應與計時電流法相結合實現克侖特羅的殘留量的定量測定。實驗中考察并優化免疫反應與酶催化反應的條件。結果表明：在優化的條件下，克侖特羅標準溶液質量濃度在0.025～2.0 μg/L范圍內呈現良好線性關系（r為0.999 2）。采用本實驗方法檢測豬肉和豬尿中克侖特羅的結果與商品化ELISA試劑盒一致。本方法檢測限分別為0.18 μg/L和0.05 μg/L，比ELISA試劑盒檢測限低一個數量級。

微型絲網印刷電極；克侖特羅；計時電流法；電化學免疫傳感

克侖特羅（clenbuterol）俗稱瘦肉精，屬于β-興奮劑，近年來被非法添加到飼料中以促進動物骨骼肌的生長和提高瘦肉率，因其添加劑量是治療劑量的5～10 倍，并且在動物體內殘留量過高而給消費者帶來危害，所以對食品中克侖特羅的檢測尤為重要[1-2]。目前克侖特羅檢測方法主要有色譜方法和免疫分析技術。高效液相色譜法[3-4]具有靈敏、準確的特點，但儀器成本高，不適合樣品篩選和現場快速檢測。免疫分析技術包括膠體金試紙條[5-6]和酶聯免疫法[7-8]。膠體金試紙條具有測定簡單、快速、成本低等特點，但難于準確定量。酶聯免疫分析方法具有靈敏度高、可定量檢測，適合樣品快速篩選分析，然而由于目前酶聯免疫檢測中采用光學酶標儀體積較大，一般不適宜攜帶進行現場的快速檢測。

電化學分析方法具有靈敏度高、儀器易于小型化、操作簡單等特點，獲得了廣泛的關注。電化學分析中計時電流方法已在商業產品中得到成功應用。例如，基于計時電流法的電化學酶傳感器已經成功用于便攜式血糖儀的研制，具有操作簡單、成本低等的優點[9-10]。在此基礎上，近年來免疫電化學分析方法也得到了廣泛關注[11-15]。免疫電化學的方法就是將電化學分析檢測與免疫學特異性分析方法相結合的一種生物傳感檢測方法，以電化學原理實現對免疫反應形成的抗原-抗體復合物的特異性檢測[16-17]。

絲網印刷電極（screen printed electrode，SPE）具有制備簡單、易于批量生產、低成本、便攜和一次性使用等優點，與傳統電化學分析方法相比，絲網印刷電極將工作電極、參比電極、輔助電極高度集成，解決了以往三電極體系分散、不易操作以及表面無法更新等問題。本實驗設計與制備了可直接插入多孔板中進行測量的小型絲網印刷電極，提高操作的方便性，并以克侖特羅為檢測目標，建立了基于96孔酶標板酶聯免疫反應的微型絲網印刷電極快速檢測方法。本方法對豬肉和豬尿中克侖特羅進行了測定，結果與ELISA試劑盒檢測結果一致，為現場檢測克侖特羅殘留的方法提供了新的測定方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

豬肉購自南京某農貿市場；豬尿取自南京某養豬廠；微型絲網印刷電極（工作電極和輔助電極為碳漿印制，參比電極為銀/氯化銀漿印制） 南京祥中生物科技有限公司。

克侖特羅抗原標準品 中國獸醫藥品監察所；克侖特羅包被抗原和抗體、克侖特羅ELISA檢測試劑盒 南京祥中生物科技有限公司；HRP標記的山羊抗小鼠IgG 北京博奧森生物公司；3,3’,5,5’-四甲基聯苯胺生工生物工程（上海）股份有限公司；過氧化氫尿素（CO(NH2)·H2O2） 天津希恩思生物公司；硫酸、甲醇、濃鹽酸、氯化鈉（分析純） 南京化學試劑公司；其他試劑均為分析純；實驗用水均為去離子水（電阻率＞18.3 MΩ·cm）。

1.2 儀器與設備

SHZ-82恒溫箱 常州智博瑞儀器公司；洗板機美國BioTek公司；CHI123B電化學分析儀 上海辰華生物有限公司；VORTEX-5振蕩器 海門市其林貝爾儀器有限公司；TG16-WS離心機 上海盧湘儀器公司；BS124 S電子天平 北京賽多利斯天平有限公司；酶標儀（450 nm/630 nm） 美國Thermo公司。

1.3 方法

1.3.1 SPE的制備

采用聚丙烯塑膠紙印刷絲網電極，每支電極尺寸規格：0.4 mm×7 mm×30 mm。基底根據自行設計的電極結構圖（如圖1），第1層（圖1a）印制銀漿作為導電介質，第2層（圖1b）印制碳作為工作電極和輔助電極，第3層（圖1c）印制銀/氯化銀漿作為參比電極。每印完一層漿料，在100 ℃條件下固化30 min。最后印制絕緣漿作為絕緣層（圖1d），100 ℃條件下烘干1 h后，通過各層漿料的疊加，制得微型絲網印刷電極（圖1e）。

圖1e中的1、2、3號接口分別與對電極導線、工作電極導線和參比電極導線連接，最后將3根導并與電化學工作站接通，電化學站則通過連有USB接口的導線與電腦相連。

圖1 絲網印刷電極印制過程Fig.1 Schematic illustration of SPE fabrication

1.3.2 微型絲網印刷電極的裝置及其檢測

基于96孔酶標板免疫反應，微型絲網印刷電極檢測的流程示意圖如圖2所示。整個流程裝置包括微型印刷電極（工作電極、輔助電極和參比電極）、96孔酶標板以及便攜式電化學分析儀。本實驗的電化學分析原理如圖3所示。首先，克侖特羅抗原標準品與包被在酶標板上的克侖特羅抗原競爭結合克侖特羅抗體，經過洗滌多孔板后，保留連接在酶標板上的抗原-抗體復合物。隨后，向孔板中加入HRP酶標二抗，二抗與酶標板上抗原-抗體復合物反應，最后加入酶底物H2O2和TMB發生酶催化反應，產生電活性物質TMB（ox），加H2SO4終止酶反應。通過插入96孔酶標板中的微型印刷絲網電極，實現對電活性產物TMB（ox）[20-22]的計時電流檢測。酶反應方程式和電信號產生的還原反應式如下。

酶催化反應：

圖2 實驗檢測裝置示意圖Fig.2 Schematic illustration of an analytical system for detecting clenbuterol

圖3 電化學免疫傳感方法示意圖Fig.3 Scheme illustration of electrochemical immunosensing method

1.3.3 酶標板包被克侖特羅抗原

采用CB包被液（0.05 mol/L的碳酸鹽緩沖溶液，pH 9.6）將克侖特羅包被抗原稀釋至1/8 000 倍，包被酶標板，100 μL/孔，4 ℃冰箱過夜（12 h以上）；使用洗板機（洗滌液：0.1 mol/L磷酸鹽-0.05%吐溫）將含包被液的酶標板清洗3 次，在吸水紙上拍干，向拍干的各孔加入封閉液（1% BSA，磷酸鹽配制）封閉，120 μL/孔，37 ℃溫育2.0 h[18-19]。

1.3.4 間接競爭免疫反應

將克侖特羅抗原標準品原液倍比稀釋后加入酶標板孔內，加入量為50 μL/孔；再將1/8 000倍稀釋的克侖特羅單克隆抗體加入到酶標板孔內（50 μL/孔），混勻，37 ℃溫育。

1.3.5 抗體與酶標二抗反應

使用洗板機將含抗原抗體反應混合物的酶標板清洗3 次，拍干后加入1/10 000倍稀釋的HRP標記的羊抗鼠酶標二抗（100 μL/孔），混勻，37 ℃溫育。

1.3.6 酶促反應及酶反應的終止

使用洗板機將含有酶標二抗的酶標板清洗3 次，拍干后加入A液（1 mmol/L H2O2）和B液（6 mmol/L TMB）各50 μL/孔，混勻，37 ℃溫育。溫育后，加入2 mol/L H2SO4，50 μL/孔，混勻。

1.3.7 電化學檢測

將微型絲網印刷電極插入已終止反應的酶標板微孔中，采用計時電流法（電壓：-0.1 V；時間：100 s）檢測終止反應后產生TMB（ox）的還原峰電流值。

1.3.8 豬肉和豬尿樣品的前處理方法

1.3.8.1 豬肉樣品

稱取（1.00±0.05）g豬肉糜樣品至10 mL聚苯乙烯離心管中，加入3 mL 4% NaCl-0.05 mol/L HCl-99.9%甲醇混合液，用振蕩器振蕩提取5 min，6 660×g以上離心5 min，取50 μL上清液用于分析（樣品稀釋倍數為4 倍）。

1.3.8.2 豬尿樣品

取50 μL清亮尿樣按照標準品測定方法進行測定。

2 結果與分析

2.1 實驗條件的優化

2.1.1 溫育時間對峰電流響應值的影響

圖4 間接免疫反應的溫育時間（A）、酶標二抗與抗體反應的溫育時間（B）和酶反應的溫育時間（C）對電流響應值的影響Fig.4 Effect of incubation time for indirect competitive reaction (A), the reaction between HRP-goat anti-mouse IgG and antibody (B), and enzymatic reaction (C) on current value

首先考察了競爭反應溫育時間對計時電流響應值的影響，結果見圖4A，可看出，隨著競爭反應溫育時間的延長，電流響應值也相應增加；當反應時間達30 min之后，電流響應值的增加幅度逐漸減小。酶標二抗與抗體反應的溫育時間對計時電流響應值的影響參見圖4B，考慮到快速檢測的需要，在滿足一定的線性范圍與檢測限要求的前提下，盡量縮短溫育時間，并參考ELISA檢測方法溫育時間的選擇，實驗中選取30 min分別作為競爭反應的溫育時間以及二抗與抗體反應的溫育時間。底物與酶反應的溫育時間對計時電流響應值的結果見圖4C。當反應時間達到15 min時，電流響應增速達到最大，綜合考慮反應時間的需要，實驗選取選15 min作為底物與酶的溫育時間。

2.1.2 酶底物濃度的選擇

2.1.2.1 H2O2濃度對峰電流響應值的影響

圖5 H2O2濃度與電流響應值關系圖Fig.5 H2O2concentration vs. current value curve

采用1.3.1～1.3.7節的實驗步驟及2.1.1節已優化的各步反應的溫育時間，B液濃度為1 mmol/L，H2O2濃度對酶產物TMB（ox）產生的電流值信號的影響結果見圖5。可知，在0～3 mmol/L之間酶產物TMB（ox）產生的還原電流信號隨著H2O2濃度的增加而增加，在3～9 mmol/L之間，產生的還原電流值基本保持不變。這是因為當酶與底物B液濃度一定時，起初隨底物H2O2濃度的增加，酶產物TMB（ox）產生的量增加，產生的還原電流的信號值也增加，但當H2O2達到一定濃度后，酶產物的量不再增加，產生的還原電流信號也基本保持不變。如果電信號基本保持不變后，繼續增加H2O2濃度，反而會抑制酶反應，使電流信號值降低（圖中未標出）。這是由于H2O2濃度存在一定的最佳值范圍，超過此范圍時，H2O2表現出一定的底物抑制效應，因為高濃度H2O2可能與酶形成死端復合物，從而抑制酶對TMB的催化[23]。所以根據實驗的結果選擇6 mmol/L作為酶反應的最佳H2O2濃度。

2.1.2.2 TMB濃度對峰電流響應值的影響

采用1.3.1～1.3.5節的實驗步驟及2.1.1節已優化的各步反應的溫育時間，A液選擇優化濃度6 mmol/L，考察了TMB濃度在0～2 mmol/L范圍內對酶產物TMB（ox）產生的電流值信號的影響，結果見圖6。在0～0.9 mmol/L之間，產生的電流值隨TMB濃度的增加而增加，但超過0.9 mmol/L以后，電流值基本不變。這是因為酶和H2O2的濃度是固定的，所以當TMB達到一定濃度時，酶產物TMB（ox）的量也基本不變，產生的還原信號也基本不變。根據實驗結果選1 mmol/L作為酶底物TMB的最佳濃度。

圖6 TMB濃度與電流響應值關系圖Fig.6 TMB concentration vs. current value curve

2.2 自制電極的重復性考察

從制備的電極條中隨機抽取10片微型絲網印刷電極，采用相同的實驗條件，在1 mmol/L鐵氰化鉀（含0.1 mol/L氯化鉀）溶液中進行循環伏安測定，以圖譜峰高作為測定標準，結果發現所測定的不同電極間的峰電流相對標準偏差為4.2%（圖略），表明所用電極的一致性較好，可用于實驗測定。

2.3 克侖特羅標準曲線與檢測限的獲得

在優化的實驗條件下，將克侖特羅標準品1 000 μg/L原液倍比稀釋得到系列標準溶液進行測定，獲得相應的標準曲線（圖7）。結果表明，克侖特羅標準溶液質量濃度在0.025～2.0 μg/L范圍內，質量濃度的半對數值與標準品的百分電流值比呈現良好線性關系，其線性回歸方程為Y=30.114 46-35.901 56X（R2=0.998 5），X為克侖特羅標準溶液質量濃度/的半對數值，Y為標準曲線百分電流值（I/I0×100，I為標準曲線溶液或樣本溶液的平均電流值，I0為0 μg/L標準溶液的平均電流值）。

圖7 克侖特羅檢測的標準曲線Fig.7 Calibration curve of clenbuterol

取10份克侖特羅空白樣品，測定得到峰電流響應值I1、I2、I3…I10，代入克侖特羅標準曲線方程Y=30.114 46-35.901 56X（R2=0.998 5），計算得到10份空白樣品含克侖特羅的質量濃度（μg/L）ρ1、ρ2、ρ3…ρ10，檢測限的計算公式為LOD=+3s（為ρ1、ρ2、ρ3…ρ10的平均值，s為ρ1、ρ2、ρ3…ρ10的標準偏差），通過測量計算得檢測限為0.021 μg/L。

2.4 交叉反應率的研究

由于酒石酸托特羅定、鹽酸環侖特羅、鹽酸氯丙那林、鹽酸妥洛特羅、沙丁胺醇、硫酸特布他林、富馬酸福莫特羅、班布特羅、萊克多巴胺可能與克侖特羅的抗體發生交叉反應，對克侖特羅測定產生干擾，所以將上述9種物質的標準品配制成10 μg/L，分別與克侖特羅抗體競爭包被的克侖特羅抗原，同時與克侖特羅空白樣品的檢測數據進行比較，得到各物質的交叉反應率，結果見圖8。鹽酸環侖特羅的交叉反應率約為8%，其他各物質的交叉反應率均小于1%。

圖8 克侖特羅與其各種類似物質的交叉反應率Fig.8 Cross-reactivity of clenbuterol with other analogues

2.5 豬肉和豬尿中的克侖特羅殘留量的檢測

分別取適量的豬肉和豬尿克侖特羅陰性樣品進行樣品前處理后，各檢測10份陰性樣品，得到峰電流響應值I1、I2、I3…I10，檢測限的計算方法同2.3節，得豬肉和豬尿檢測限分別為0.18 μg/L和0.05 μg/L。所購克侖特羅ELISA檢測試劑盒對豬肉和豬尿的檢測限分別為1.00 μg/L和0.50 μg/L。向豬肉陰性樣品中加入克侖特羅標準品，得到分別含1.00、2.00、4.00 μg/L的克侖特羅豬肉樣品，檢測過程同1.3.1～1.3.5節的實驗步驟，測定加標回收率，見表1。同樣，豬尿陰性樣品中加入克侖特羅標準品，得到分別含0.30、0.80、1.00 μg/L的克侖特羅豬尿樣品，測定加標回收率，見表2。

表1 豬肉中克侖特羅加標回收率的測定Table 1 Recovery of clenbuterol from spiked pork

表2 豬尿中克侖特羅加標回收率的測定Table 2 Recovery of clenbuterol from spiked swine urine

所購克侖特羅ELISA檢測試劑盒，標準溶液質量濃度在0.05～1.35 μg/L范圍內呈現良好線性關系（r=0.992 5），線性方程為Y=0.117 08-0.625 19X。應用ELISA方法對克侖特羅加標回收率進行測定，當豬肉陰性樣品中加入1.00 μg/L克侖特羅標準品時，實際檢測值為（0.99±0.03）μg/L，回收率為（99.13±2.98）%。豬尿陰性樣品中加入0.30、0.80、1.00 μg/L克侖特羅標準品，測定加標回收率，見表3。

表3 ELISA法測定豬尿中克侖特羅加標回收率Table 3 Recovery of clenbuterol from spiked swine urine by ELISA

分別取適量經過前處理的豬肉和豬尿樣品進行檢測，檢測結果為：豬肉中克侖特羅含0.228 μg/L，豬尿中克侖特羅含0.06 μg/L，都符合國家標準（動物性食品中克侖特羅檢出量要小于1 μg/L），認為是陰性樣品，與克侖特羅的ELISA試劑盒檢測結果一致。

3 結 論

將微型絲網印刷電極與96孔酶標板組成微型生物電化學檢測裝置，通過間接競爭免疫反應，最后采用電化學檢測手段來測定動物性食品中克侖特羅的殘留量，該方法特異性高、簡單、成本低，裝置微型化、便于攜帶，為現場檢測克侖特羅的方法提供了 一種新的測定方法。

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On-site Electrochemical Detection of Clenbuterol Based on Mini-Screen Printed Electrodes

LIANG Hua1, SONG Wei2, XU Dan-ke2, LIU Ying3, ZHONG Wen-ying1,*
(1. School of Science, China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, China; 2. School of Chemistry and Chemical Engineering, Nanjing University, Nanjing 210093, China; 3. Nanjing Xiang Zhong Biotechnology Co. Ltd., Nanjing 210022, China)

An electrochemical sensing method for the detection of clenbuterol (CLB) was developed based on miniscreen printed electrodes and 96-well microtiter plate. Clenbuterol residues were indirectly detected by combined use of indirect competitive immunoreaction and chronoamperometry. The immune reaction and enzymatic reaction conditions were investigated. Under the optimized conditions, the results showed that the electrochemical immunosensor produced a linear range of 0.025–2.0 μg/L with a correlation coeff i cient of 0.999 2. The analytical results of CLB residues in pork and swine urine samples were consistent with those obtained with an enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) plate. The detection limits for pork and swine urine samples were 0.18 μg/L and 0.05 μg/L, respectively, showing a decrease of one order of magnitude in comparison with those of ELISA.

mini-screen printed electrode; clenbuterol; chronoamperometry; electrochemical immunosensor

TS207.3

A

1002-6630（2014）08-0099-06

10.7506/spkx1002-6630-201408019

2013-08-07

國家重點基礎研究發展計劃（973計劃）項目（2011CB911003）；國家自然科學基金面上項目（21175066；21227009）；江蘇省科技支撐計劃項目（BE2011773）；江蘇省環境監測科研基金項目（1116）；國家創新研究群體科學基金項目（21121091）

梁樺（1987—），女，碩士研究生，研究方向為電化學傳感器。E-mail：lianghua257@aliyun.com

*通信作者：鐘文英（1968—），女，教授，博士，研究方向為儀器分析。E-mail：wyzhong@cpu.edu.cn