基于信號增敏型試紙條三聚氰胺超靈敏檢測方法

鐘友好，趙弟萍，薛 峰，朱夢雅，方 威，陳 偉*

（合肥工業大學生物與食品工程學院，安徽 合肥 230009）

2008年8月我國發生了三聚氰胺問題奶粉事件，截至2008年8月27日全國已累計篩查嬰幼兒2 238.4萬人次，累計報告泌尿系統出現異常的患兒29.4萬 人，其中甘肅省食用三聚氰胺污染奶粉泌尿系統結石患病率高達8.96%[1]，安徽省人民醫院統計泌尿系統結石患病率為7.97%[2]，“毒奶粉”事件將三聚氰胺這一化學名詞帶入普通民眾實際生活中，一時大家談“奶粉”色變。

三聚氰胺化學名1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺，是一種三嗪類含氮雜環有機化合物，重要氮雜環有機化工原料[3]，主要用作生產三聚氰胺甲醛樹脂的原料還可作為甲醛清潔劑、減水劑、阻燃劑等[4]。 目前所使用的“凱氏定氮法”[5]存在著無法測出氮來源的缺陷。通過添加三聚氰胺會使以凱氏定氮法測定的蛋白質虛漲，因而三聚氰胺常被不法商人用作添加劑，以提升蛋白質含量指標[6]。三聚氰胺毒性輕微，但人體長期攝入，尤其是嬰幼兒，會造成生殖、泌尿系統的損害，膀胱、腎部結石，并可進一步誘發膀胱癌[7]。目前三聚氰胺的檢測已成為乳制品檢測中的一項必檢項目。

金納米粒子也稱為膠體金，是指一種分散相粒徑在1～150 nm之間的金溶液，屬于多相不均勻體系，其顏色隨粒徑大小不同從而呈現出由橘紅色到紫紅色的變化。膠體金在藥物小分子檢測、抗原抗體標記、分子生物學和化學反應催化等方面得到了廣泛的應用[8]。金納米粒子常用于標記特定的抗原抗體制備出的膠體金標記物從而開發出被分析物的快速免疫檢測的方法，如膠體金免疫層析法。

膠體金免疫層析（gold immunochromatography assay，GICA）是20世紀90年代出現的一種快速檢測技術，是一種將膠體金標記技術、免疫檢測技術和層析分析技術等多種方法有機結合起來的一種固相標記免疫檢測技術[9]，其原理是：將特異性的抗原或抗體固定于硝酸纖維素（nitrocellulose，NC）膜等固相載體的一端，而后將此端浸入待檢樣品溶液中，然后以NC膜為載體，利用微孔膜的毛細管作用，使滴加在膜一端的液體慢慢向膜的另一端滲移，在此遷移過程中，各種免疫反應試劑進行特異性結合，最后通過目測膠體金標記物的顯色情況從而到達目標物的檢測，并且膠體金可與抗體分子形成較牢固的結合物，并且不影響抗體的生物特性[10]。與其他免疫分析方法相比，GICA具有不需要專用儀器、檢測速度快、操作簡單方便、可長期保存實驗結果、易于實現現場檢測等優點，主要作為定性或半定量篩選檢測手段[11-12]。目前，GICA法已經廣泛應用于各種毒素，生物大分子和抗生素的檢測[13-15]。梅占龍等[16]成功建立利用膠體金免疫層析試紙條對塑料水杯中雙酚A的快速超靈敏檢測方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

99.9%三聚氰胺（化學純）、檸檬酸三鈉（分析純）、磷酸氫二鈉（分析純）、磷酸二氫鈉（分析純）、甘氨酸（Gly）、賴氨酸（Lys） 國藥集團化學試劑有限公司；牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA，純度大于98%）、人血清白蛋白（human serum albumin，HSA） 北京拜爾迪生物科技公司；氯金酸百靈威科技有限公司；硝酸纖維素膜（NC膜）、玻璃纖維膜、吸水墊、聚氯乙烯（polyvinyl chloride，PVC）底板 上海金標生物科技有限公司；三聚氰胺人工抗原、羊抗鼠二抗、三聚氰胺人工抗原小鼠腹水單克隆抗體、BSA抗體均由江蘇省出入境檢驗檢疫局提供。

1.2 儀器與設備

Heraeus Fresco 17高速冷凍離心機 美國賽默飛科技公司；2802 UV/Vis紫外分光光度計 山東寶萊科技股份有限公司；XYZ3000金標點樣儀、CM4000金標切條機美國Bio-Dot公司。

1.3 方法

1.3.1 膠體金的制備與鑒定

本實驗中所使用的膠體金采用檸檬酸三鈉還原法[17]制備。取250 mL錐形瓶先用水洗干凈，再用王水浸泡24 h后洗凈烘干備用。錐心瓶中加入50 mL質量濃度為0.1 g/L的氯金酸溶液，加雙蒸水置50 mL放于磁力攪拌器上加熱至沸騰。維持1 300 r/min的攪拌轉速不變，迅速加入一定體積的質量濃度為10 g/L的檸檬酸三鈉溶液[18]。溶液的顏色在2 min內發生明顯變化，至顏色不變后繼續加熱煮沸5 min。冷卻后加雙蒸水補至50 mL，放在0～4 ℃條件下保存待用。不同的金納米粒子粒徑所用的檸檬酸三鈉量的關系及顏色如表1所示。

注：本實驗中所用為理論粒徑25 nm的膠體金顆粒。

通過紫外-可見分光光度計掃描膠體金在350～850 nm處的吸光度，獲得膠體金紫外吸收光譜，測得最大吸收波長[19]。30 d后再進行顏色和吸收光譜確證。

1.3.2 膠體金-三聚氰胺單克隆抗體復合物的制備

1.3.2.1 常規標記與重懸純化

用0.1 mol/L K2CO3溶液將制得的膠體金溶液pH值調至8.0，然后加入一定量的三聚氰胺抗體，在室溫條件下孵育1 h后再向其中加入100 μL質量分數為10% BSA溶液 ，混合溶液再繼續反應30 min后即得到膠體金-三聚氰胺單克隆抗體復合物。將復合物于4 ℃，9 500 r/min離心7 min，移去上清液，沉淀用重懸液重懸，即制成膠體金-三聚氰胺單克隆抗體復合物濃縮液。

1.3.2.2 增敏標記與重懸純化

向1 mL已調pH值的膠體金中加入10 μL抗BSA抗體，混勻靜置1 h，之后加入80 μL質量分數10%的人血清白蛋白，混勻靜置30 min。在4 ℃，9 500 r/min離心7 min，移去上清液，沉淀物用重懸液進行重懸，即制成增敏標記復合物濃縮液。

1.3.3 試紙條原料的預處理

1）將作為結合墊的玻璃纖維膜置于金標墊預處理液中浸泡2 h，取出放于37 ℃烘干后切成4 mm×5 mm，將6 μL膠體金-三聚氰胺單克隆抗體復合物滴加在金標墊上，于25 ℃干燥完成后放于4 ℃條件下保存；2）樣品墊在樣品墊預處理液中浸泡2 h后取出于37 ℃條件下烘干待用；3）將不同濃度的三聚氰胺人工抗原和羊抗鼠二抗用噴膜儀包被在NC膜上，形成間隔5 mm的檢測線（test line，T線）和質控線（control line，C線），37 ℃條件下烘干3 h，取出置于4 ℃避光干燥保存。

1.3.4 三聚氰胺檢測試紙條的組裝

上述已處理過的樣品墊、NC膜、吸水墊按順序分別粘貼在PVC底板上，用切條機切成4 mm寬的條狀，置于4 ℃避光干燥貯存。如圖1所示，結合墊和增強墊組裝在試紙條上完成試紙條的全部組裝步驟，便可用于檢測。此外，為了保證實驗過程中結果的可重復性，在制備半成品試紙條、識別墊及增強墊時數目可達上百，之后用鋁箔紙封閉置于恒溫恒濕環境中貯存備用。

圖 1 增敏型免疫層析試紙條結構圖Fig.1 Structure of the enhanced sensitivity test strip

1.3.5 試紙條結果判定標準在T線和C線處均出現紅色線條判定為陰性；T線處出現淺紅色線條判定為弱陽性；T線處未出現線條，C線處出現紅色或淺紅色線條判定為陽性；C線處未出現線條，無論T線是否出現線條，均判定為檢測無效。

1.3.6 試紙條的優化

1.3.6.1 抗體加入量在同樣體積已調pH值膠體金溶液中加入不同體積的三聚氰胺單克隆抗體，實驗設計見表2。

表 2 復合物偶聯抗體加入量實驗設計Table 2 Experimental design for the amount of complex coupled antibody Table 2 Experimental design for the amount of complex coupled antibody序號 膠體金溶液/mL 三聚氰胺單克隆抗體/μL 1 1 4 2 1 6 3 1 8 4 1 10 5 1 12 6 1 14

1.3.6.2 反應體系的優化

采用了超純水、磷酸緩沖溶液（10 mmol/L，pH 7.4）兩種反應體系。將三聚氰胺標準溶液分別用這兩種溶液配制成100 μg/L的標準液，用于試紙條檢測，觀察記錄T、C線的顯色強度和顯色穩定時間。

1.3.6.3 金標墊上復合物滴加量

在4 mm×5 mm的金標墊上分別滴加3、4、5、6、7 μL的偶聯復合物，干燥待用。

該優化實驗中所用三聚氰胺樣品均為用10%乙醇溶液助溶的三聚氰胺標準樣品液，樣品液質量濃度梯度為0、10、50、100、500、1 000 μg/L，5、10、50、100、500、1 000 mg/L。

1.3.7 試紙條特異性實驗

將含氨基有機化合物Gly、Lys、4-ATP和d-NTP分別用PBS緩沖溶液配制成質量濃度為1 mg/L溶液，用質量濃度為50 μg/L的三聚氰胺標準樣品和PBS緩沖溶液作為對照組，用試紙條檢測，觀察試紙條顯色情況。

1.3.8 食品樣品中三聚氰胺殘留檢測

1）從超市購入新鮮牛奶經液相色譜確證陰性后，取10 mL牛奶加入不同量的三聚氰胺標準樣品使牛奶中三聚氰胺添加量達到500、200、100、50 μg/L，編號為食品樣品1、2、3、4；2）取新鮮牛奶樣品為食品樣品5，作為空白對照。加入標樣處理1 h后，在4 ℃、4 000 r/min離心15 min，除去上層脂肪即可用于檢測[20]；3）樣品檢測：在三聚氰胺膠體金試紙條樣品墊上滴加樣品80 μL，反應5～10 min后，讀取并判定結果。每個樣品重復3 次。

2 結果與分析

2.1 膠體金的評價與鑒定

通過肉眼觀察，制備的膠體金溶液呈現透亮無雜質的酒紅色，符合25 nm粒徑的膠體金溶液顏色特征，掃描350～850 nm波長范圍吸光度，結果如圖2所示。可以看出25 nm膠體金溶液在520 nm左右有特征峰，峰形尖銳平滑，說明制得的膠體金粒徑均一，形狀規則。為了進一步驗證實驗中所制備的膠體金的穩定性，將制備的膠體金取出一部分后貯存用于4 ℃條件下檢驗其穩定性。膠體金存放30 d后的紫外圖譜，與現制膠體金紫外圖譜基本一致，表明所制膠體金穩定性比較好。

圖 2 25 nm現制膠體金溶液與儲存30 d后紫外-可見吸收光譜圖Fig.2 UV-visible spectrum of synthesized 25 nm gold nanoparticles after being stored for 30 d

2.2 實驗參數的優化

2.2.1 抗體加入量對檢測結果的影響

注：*.數量多少表示顯色的深淺程度。下同。

從表3可見，C線顯色強度穩定能夠有效；T線顯色程度先隨著抗體加入體積的增加而增加，6 μL后顯色強度趨于穩定。根據免疫層析試紙條檢測原理，在試紙條上抗體-包被原結合部位的金顆粒達到一定數量（107粒/mm2）時，肉眼即可觀察到紅色斑點或線條的出現[21]。經分析這種顯色變化是由于膠體金上抗體和包被原之間反應的飽和性導致，2 μL和4 μL組是由于加入抗體較少，三聚氰胺大量與抗體結合，使能夠與T線處包被原充分接觸反應的抗體減少導致在T線處捕獲固定的金納米顆粒較少，影響了線條出現產生不同的顯色強度；而6 μL組能夠滿足抗原與抗體之間的充分接觸反應達到飽和，T線處包被原全部與抗體發生反應，大量的金納米粒子聚集使顯色強度增加，8、10、12 μL組的抗體已處于過飽和狀態，過量標記過的抗體隨著毛細作用流向吸水墊，因而與6 μL組顯色相近。因此從經濟性和有效性考慮選擇6 μL為抗體最適加入量。

2.2.2 反應體系對試紙條檢測的影響

表 4 上樣緩沖液體系的影響Table 4 Impact of sample buffer systems on the color reaction Table 4 Impact of sample buffer systems on the color reaction指標 反應體系超純水 磷酸緩沖溶液顯色強度 *** ****顯色穩定平均時間/min 8 5

從表4可以看出，磷酸緩沖液組的顯色強度與超純水組相比更強，而且達到顯色穩定所需時間短，是因為磷酸緩沖溶液能夠為抗原抗體反應提供更好的pH值，使整個免疫反應在一個穩定適合的體系中進行，因而顯色效果要優于超純水體系，并且加快了反應速度，因此選擇磷酸緩沖溶液作為后續實驗反應體系。

2.2.3 結合墊上滴加量對結果的影響

表 5 結合墊上滴加量對試紙條檢測結果的影響Table 5 Effect of different quantities of pad added on test strip Table 5 Effect of different quantities of pad added on test strip指標 結合墊滴加量/μL 3 4 5 6 7 C線顯色強度 *** *** *** *** ***T線顯色強度 * ** *** **** ****顯色穩定平均時間/min 11 10 8 6 5

由表5可知，隨著金標墊上膠體金與抗體偶聯物量的增加，T線顯色強度逐漸增強，C線強度穩定，并且達到顯色穩定所需時間短。當金標墊滴加量為6 μL和7 μL時T線顯色效果都很好且7 μL組顯色穩定所需時間更短，所以選擇金標墊滴加量為7 μL作為后續實驗滴加量。

2.3 傳統型試紙條和增敏型試紙條檢測靈敏度

圖 3 傳統型和增敏型試紙條對比Fig.3 Comparison of sensitivity between the traditional and the enhanced strips

從圖3A可知，傳統型試紙條在0～10 μg/L范圍隨著檢測物質量濃度的增加，試紙條T線顯色逐漸減弱，減弱趨勢與三聚氰胺質量濃度呈現負相關。10 μg/L時T線減弱十分明顯；隨著三聚氰胺質量濃度的增加，C線峰面積基本不變，T線隨著質量濃度增加峰面積逐漸減小。

從圖3B可知，增敏型試紙條在0～5 μg/L范圍內隨著三聚氰胺質量濃度增加C線顯色清晰，顯色強度強、顏色深、背景輕，這是因為增強墊上膠體金表面偶聯的抗BSA抗體可與C線表面捕獲的膠體金表面的BSA相結合，使C線處固定的膠體金增多，因而增敏后C線顯色明顯增強，線顯色逐漸減弱，靈敏度明顯提高，當三聚氰胺質量濃度達到0.5 μg/L時T線減弱已很明顯，因此可將其作為增敏型試紙條肉眼的最低檢測限；對于C、T檢測線結果的灰度掃描結果與C線的峰面積基本一致，T線峰面積呈現一定的線性減弱趨勢。

圖 4 傳統型和增敏型試紙條灰度掃描C、T線峰面積曲線Fig.4 Grayscale scanning peak areas of C and T lines for the traditional and the enhanced strips

對兩種類型試紙條檢測結果峰面積曲線的對比（圖4）顯示兩種試紙條的C線峰面積均不隨著三聚氰胺質量濃度增加而增加，基本保持一致，傳統型試紙條T線在0～10 μg/L的線性較好，最低檢測限為10 μg/L，而增敏型試紙條檢測在0～0.5 μg/L存在比較好的線性，最低檢測限為0.5 μg/L，相比傳統型試紙條將檢測限提高了20倍。

以上結果表明這種增敏方法對試紙條檢測靈敏度具有較強的增敏效果，由此可見已成功建立一種基于膠體金免疫層析試紙條的三聚氰胺增敏檢測新方法。

2.4 特異性實驗

圖5a顯示：C線均顯色清晰，強度好，試紙條背景干凈；在檢測質量濃度為50 μg/L的三聚氰胺樣品時，T線基本消線，其他含氨基待檢測物（Gly、Lys、4-ATP和dNTP質量濃度均為1 000 μg/L）以及上樣緩沖液PBS都不能使T線減弱，說明除增敏型試紙條對三聚氰胺具有很高的特異性；圖5b中對于試紙條檢測線的灰度掃描結果也顯示除三聚氰胺外其他含氨基物質均無法使T線消線；圖5c中柱狀圖更直觀的顯示了這種方法檢測特異性好，發生交叉反應率低。特異性實驗結果表明含氨基類化合物無法與三聚氰胺單克隆抗體發生免疫反應，不能干擾檢測結果，這種增敏的免疫層析檢測方法具有優異的特異性。

2.5 食品樣品中三聚氰胺殘留檢測

圖 5 特異性實驗Fig.5 Specificity testing

圖 6 牛奶樣品三聚氰胺檢測結果Fig.6 Test results for melamine in milk samples

由圖6a可知，隨牛奶中三聚氰胺質量濃度（0、1、2、5、10 μg/L）的增加傳統型試紙條T線顯色逐漸減弱，符合T線強度與三聚氰胺質量濃度的負相關關系，C線顯色強度一致，試紙條整體顯色清晰背景干凈，檢測結果辨識度高，在三聚氰胺質量濃度為10 μg/L時T線完全消線，可見傳統型試紙條對于實際樣品最低檢測限為10 μg/L；由圖6b可知，增敏型試紙條對牛奶實際樣品的檢測，增敏型試紙條C、T線顯色清晰，背景弱，T線顯色隨著牛奶中三聚氰胺質量濃度（0、0.1、0.2、0.5、1、2、5 μg/L）增加而逐漸減弱，在三聚氰胺質量濃度為2 μg/L時，傳統試紙條T線無法消線，而增敏試紙條T線能夠完全消線，可判定增敏型試紙條對于實際樣品的最低檢測限為2 μg/L。由于實際樣品檢測時，實際樣品的pH值、鹽離子以及其他雜質的影響，相比于實驗條件下抗體的效價會有減弱，所以檢測靈敏度提高效果不及標準樣品實驗條件下靈敏度提高的效果好，增敏效果略有減弱，因此相比于傳統型試紙條檢測這一結果靈敏度只提高了5 倍。這一檢測結果遠低于國家標準對于嬰兒配方奶粉中三聚氰胺含量不得高于1 mg/kg、液態奶及成人奶粉中不高于2.5 mg/kg的規定[22]，也遠低于市面上快靈生物、德諾泰克、綠洲生化和華安麥科等公司所售試紙條對于奶粉及液態奶的1 000 μg/L的檢測靈敏度，同時也表明這種新方法也適用于實際樣品檢測。

3 討論與結論

膠體金免疫層析技術是以膠體金標記技術、免疫技術和層析技術為基礎發展出來的一項快速檢測技術[23]。由于其具有高效性、快速性、簡便性，在現場篩查、高通量快速檢測中得以廣泛應用。本實驗研發的三聚氰胺膠體金免疫層析試紙條利用的是抗原抗體特異性反應原理[24-25]，在傳統的基于競爭法的三聚氰胺免疫層析試紙條基礎上通過增加增強墊建立了一種能夠顯著提高靈敏度的半定量檢測新方法，與傳統檢測方法相比，既保留了檢測樣品無需預處理、檢測快速等優點，又顯著地提高了檢測靈敏度。在最優化條件下增敏型試紙條對于三聚氰胺的最低檢測限為0.5 μg/L，檢測范圍為0.1～5 μg/L，檢測時間10 min，檢測特異性好，假陽性出現率低，同時也適用牛奶樣品中三聚氰胺殘留檢測。

這種新方法能夠有效解決目前試紙條檢測靈敏度低的缺點，將極大地拓展免疫層析試紙條的應用范圍，對于提升我國現場檢測和食品監測水平提供重要的技術參考。

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