新霉素半定量膠體金試紙條的研制

王麗哲，趙 瑜，唐慧林，王麗麗，于重楠，劉 敏，何艷玲

（1.北京陸橋技術有限責任公司，北京 100123；2.中國檢驗檢疫科學研究院，北京 100123）

新霉素屬于常見氨基糖苷類藥物之一，在獸醫臨床飼料添加劑中有廣泛應用，對于奶牛乳房炎、子宮內膜炎的治療上有很都有很好地療效[1-2]。然而，新霉素對人類具有明顯的毒害作用，尤其是耳毒性與腎臟毒性。隨著新霉素的大量使用，該藥物的殘留檢測也漸漸被人所重視，國家及歐盟對新霉素的殘留有嚴格要求[3-6]，我國農業部發布的“動物性食品中獸藥殘留限量”（農業部235號公告）中規定，新霉素在牛乳中殘留不能超過500 μg/kg，與歐盟規定的牛乳中新霉素殘留最高限量一致。

本研究開發了一種半定量檢測牛乳中新霉素的膠體金試紙條，在傳統膠體金檢測技術[7-9]的基礎上加以改進，包含有一條控制線（C線），兩條不同限量的檢測線T1、T2（均包被目標檢測物全抗原），用于牛乳樣品中目標殘留物的半定量檢測。通過牛乳樣品中的目標殘留物與呈橫條狀分布于免疫層析膜上的 T1、T2線共同競爭性的與膠體金標記抗體反應，由免疫層析膜上T1、T2線的顯色情況來判定待檢樣品中目標殘留物的含量范圍，當層析膜上的T1、T2均顯色時，說明待檢測樣品中的殘留物含量低于最低檢測限；當層析膜上T1、T2線只有一條顯色，說明待檢測樣品中殘留物的含量在最低檢測限和最高檢測限之間；當層析膜上T1、T2線均不顯色，僅有C線顯色時，說明待檢測樣品中殘留物的含量超過了最高檢測限。該新霉素半定量金標快速檢測試劑盒，最低檢測限為200 μg/kg，最高檢測限為400 μg/kg。設定的最低檢測限可以滿足企業對于優質奶源分級篩選的要求，根據市場調查，客戶在選用快速檢測產品時，多要求檢測靈敏度低于國家標準，故最高檢測限400 μg/kg在滿足國家對新霉素藥物最高殘留限量要求的同時，更適合企業實際檢測要求。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氯金酸、羊抗鼠抗抗體、新霉素標準品 美國Sigma公司；硝酸纖維素膜、膠體金結合墊、樣品墊、吸水墊、塑料背襯 美國Millipore公司；其他試劑均為國產分析純。

1.2 設備與儀器

BioJet XYZ 3050點膜儀 美國BioDot公司；ZQ5000數控斬切機 上海金標生物技術公司；3K15高速低溫離心機 美國Sigma公司；BT-47水浴鍋 日本Yamato公司；Ic160恒溫培養箱 瑞士Salvis公司；HJ-3恒溫磁力攪拌器 金壇市科興儀器廠；FF40冰箱 青島海爾集團；MDF-192AT冷藏柜 日本Sanyo公司；MS1 Minishaker渦旋振蕩器 德國IKA公司。

1.3 方法

1.3.1 新霉素偶聯抗原合成[10-14]

新霉素屬于小分子抗原，需要與其他蛋白偶聯制備成全抗原方具有免疫原性，并得以競爭法制備膠體金試紙條。稱取20 mg新霉素硫酸鹽和10 mg牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA），分別溶解于1 mL的蒸餾水中，將BSA溶液逐滴加入到新霉素溶液中，室溫下于磁力攪拌器上攪拌2 h以上。取70 mg 1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亞胺鹽酸鹽（1-ethyl-3(3-dimethyllaminopropyl) carbodiie hydrochlide，EDC·HCl）溶于1 mL蒸餾水中，再逐滴加入到上述溶液中，在室溫條件下繼續攪拌1 h以上，然后于4 ℃放置過夜。用PBS（1 L配方：KH2PO40.27 g、Na2HPO41.42 g、NaCl 8 g、KCl 0.2 g、pH 7.2～7.4）透析3 d后，分裝，－20 ℃貯存。

1.3.2 抗體-膠體金標記

1.3.2.1 膠體金溶液的制備

將1 g氯金酸溶于超純水配制得0.01%的氯化金溶液，取100 mL加熱至沸騰，在攪動狀態下加入1.5 mL的1%檸檬酸三鈉溶液。繼續加熱煮沸15 min，隨后冷卻至室溫，用超純水恢復至原體積，在510～550 nm波長范圍內測定其最大吸收波長，4 ℃避光保存。

1.3.2.2 最適標記pH值的確定

取15 個1.5 mL試管，分別加入1 mL 制備好的膠體金溶液；用0.1 mol/L K2CO3溶液調節pH值分別為3、4、5、6、7、8、9、10，混合后室溫放置10 min；加入質量濃度為0.2 mg/mL的新霉素抗體，每管各60 L，混合后室溫放置30 min；觀察膠體金顏色變化直到室溫條件下放置2 h，仍保持紅色，且實驗結果符合檢測靈敏度的為最低pH值。

1.3.2.3 最低標記蛋白量的確定

取6 個1.5 mL試管，分別加入1 mL 制備好的膠體金溶液；用0.1 mol/L K2CO3溶液調節pH值為最適pH值，混合后室溫放置10 min；加入0.2 mg/mL的新霉素抗體，分別為5、1 0、1 5、2 0、2 5、30 L混合后室溫放置30 min；加入25 mg/mL聚乙二醇20000封閉，封閉液終質量濃度為4 mg/mL，顏色仍保持紅色，且最終檢測靈敏度符合實驗要求的最小蛋白用量即最小蛋白標記量。

1.3.2.4 抗體-膠體金復合物制備

取已制備好的膠體金溶液50 mL，用0.1 mol/L K2CO3溶液調pH值至最適標記pH值。攪拌中加入抗體至最適標記蛋白量，繼續攪拌20 min，加入10% BSA溶液直至BSA的終含量為1%，繼續攪拌10 min；在4 ℃、12 000 r/min離心30 min，小心棄去上清液，加入50 mL 0.01 mol/L Tris-HCl溶液（pH 8.2，含1% BSA，簡稱TBS）再重復清洗一次，最后用100 mL 0.01 mol/L TBS將沉淀重懸，0.22 μm微孔濾膜過濾，按照2 mL量包被1 cm×30 cm玻璃纖維，37 ℃恒溫培養箱2 h，烘干備用。

1.4 免疫層析膠體金試紙條的制備[15-18]

1.4.1 檢測線、控制線包被濃度的確定

用包被緩沖液（PBS，配方同1.3.1節）稀釋新霉素偶聯抗原，設置點膜儀參數為0.1 L/mm，包被T1、T2兩條不同質量濃度的新霉素偶聯抗原在2.5 cm×30 cm硝酸纖維素膜上（無需封閉），作為層析試紙條的檢測線；包被二抗（兔抗鼠抗體）在同一硝酸纖維素膜上作為層析試紙條的控制線，其中控制線包被在兩條檢測線上方，37 ℃恒溫培養箱2 h，烘干備用；以抗體-膠體金復合物在膠體金結合墊上作為游離反應物，通過分析對添加新霉素標準品的檢測結果，調整T1、T2兩條檢測線的包被質量濃度，使T1、T2在檢測牛乳樣品時，新霉素最終靈敏度分別為200 μg/kg和400 μg/kg。

1.4.2 膠體金試紙條各組分的組裝

樣品墊（預先切割成2 cm×30 cm規格的玻璃纖維），經預處理液（Na2B4O710H2O 38.130 g、PVP-10 10 g、BSA 1 g、Triton X-100溶液 10 mL，溶于1 L蒸餾水，硼酸顆粒調節pH（8.5±0.1））處理：1 000 mL樣品墊預處理液倒入塑料盒中，放入200 條樣品墊充分浸泡5 min，用手去掉多余的液體。將處理后的樣品墊放于已洗凈并烘干的篩網上，整齊平鋪后放于37 ℃干燥箱中過夜干燥。

吸水墊制備用裁紙刀切割成3.8 cm×30 cm的規格備用。依次將吸水墊、包被有T1、T2線和C線的硝酸纖維素膜、膠體金結合墊和樣品墊依次貼到PVC背襯上，組裝成大卡，粘貼5.5 cm×30 cm Max線標簽于膠體金結合墊和樣品墊上將其固定；然后將大卡用斬切機切割成4 mm寬度的試紙條，用于后續實驗。

1.4.3 樣品檢測

向不含氨基糖苷類抗生素的陰性牛乳樣中添加0～500 μg/kg的新霉素標準品，檢測試紙條T1、T2線的靈敏度，每個添加樣品平行數為10，并對50 份未知牛乳樣，分別使用試紙條和儀器方法GB/T 21323—2007 《動物組織中氨基糖苷類藥物殘留量的測定：高效液相色譜-質譜法/質譜法》進行檢測，比對結果的一致性。

取所需數量空白酶標板微孔，置于微孔板上；向每個微孔中依次加入100 L樣品稀釋液（PBS）和100 L待測牛乳樣，混勻，待測。從塑料筒中取出檢測條，向每孔中插入試紙條，等待5 min觀察結果，20 min后結果無效。結果判定：T1、T2線和C線均顯色，判斷為陰性；T1線不顯色，T2線及C線顯色，判斷為高靈敏度陽性；T1、T2線均不顯色，C線顯色，判斷為低靈敏度陽性；C線不顯色，判定試紙條失效。

2 結果與分析

2.1 膠體金溶液的制備

所制備的膠體金顏色為紅色，透明，用全波長酶標儀在510～550 nm波長范圍內測定其最大吸收波長，其最大吸光度為1.149，對應的吸收波長為528 nm（圖1）。

圖 1 膠體金溶液最大吸收波長掃描圖Fig.1 Maximum absorption wavelength of the colloidal gold solution

2.2 最適pH值的確定

從上述實驗確定最適標記pH值為8，與大多數小分子膠體金抗體標記最適pH值相近。

2.3 最低標記蛋白量的確定

最終實驗結果，確定最小蛋白用量為15 L，即3 g/mL，符合競爭法蛋白標記量較低的預期量。

2.4 免疫層析膠體金試紙條的制備

制備的半定量膠體金試紙條與傳統膠體金試紙條相比，多了一條檢測線，經實驗檢測最終結果驗證，確定控制線包被質量濃度為0.3 mg/mL，兩條檢測線T1、T2抗原包被質量濃度分別為0.03 mg/mL和0.1 mg/mL。

2.5 樣品檢測

試紙條檢測含有100、200、300、400 μg/kg和500 μg/kg的新霉素時，添加至100 μg/kg時，T1、T2線顏色均有變淺趨勢，添加至200 μg/kg，100% T1檢測線消線，添加至400 μg/kg，100% T2檢測線消線，因此組裝的免疫膠體金試紙條檢測牛乳樣品，T1、T2兩條檢測線的靈敏度可分別達到200 μg/kg和400 μg/kg（圖2、3）。且樣品僅需稀釋即可上樣檢測，5 min之內即可出結果，方法簡便，可實現現場快速檢測，肉眼觀察結果可維持20 min不變（圖4），結果穩定。

圖 2 陰性牛乳樣品添加新霉素標準品200 g/kg和400 g/kg檢測結果Fig.2 Results obtained from the strip for negative milk samples spiked neomycin standard at 200 g/kg and 400 g/kg

圖 3 陰性牛乳樣品添加新霉素標準品100～500 g/kg檢測結果Fig.3 Results obtained from the strip for negative milk samples spiked with neomycin standard at concentrations of 100–500 g/kg

圖 4 試劑條檢測含200 g/kg和400 g/kg新霉素牛乳在5、10、15、20 min時的檢測結果Fig.4 Results obtained from the strip for milk samples spiked with neomycin standard at 200 and 400 g/kg at different testing times (5, 10,15 and 20 min)

注：χ2=0；P＞0.05；符合率：100%。

對50 份盲樣牛乳的檢測結果，與高效液相色譜-質譜法一致，結果準確可靠（表1）。

3 討論與結論

膠體金免疫層析技術是出現于20世紀80年代的一種獨特的免疫學檢測技術，其操作簡單、快速、特異性好，結果清楚，易于判斷和保存，且無需儀器。但由于目前只能進行定性測定，因此阻礙了這一技術的進一步應用。為此本研究就膠體金免疫層析技術進行半定量測定改進[19-20]，相對于酶聯免疫吸附半定量方法來說，操作更簡便，不需要酶標儀等設備，能夠實現現場快速檢測，使膠體金試紙條這一檢測方法精確度更高，滿足市場對牛乳質量檢測監控的需要。

本研究所制備的免疫層析試紙條在檢測牛乳樣品時，檢測方法簡單，所需檢測時間短，可實現現場快速檢測，為不僅實現對樣品的定性檢測，更能對樣品進行半定量檢測，為乳制品質量控制技術提供了便捷的方法。

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