丹參和氫化可的松對重癥急性胰腺炎大鼠三磷酸肌醇及鈣代謝的影響

王行，石承先

·藥理毒理·

丹參和氫化可的松對重癥急性胰腺炎大鼠三磷酸肌醇及鈣代謝的影響

王行1，石承先2

目的：觀察重癥急性胰腺炎(SAP)動物模型三磷酸肌醇（IP3）的變化及與鈣代謝的關系和丹參及糖皮質激素的影響。方法：50只SD大鼠隨機分5組：SAP模型組（SAP組）、丹參治療組（A組）、氫化可的松治療組（B組）、丹參加氫化可的松治療組（AB組）和對照組(C組)，各10只。SAP組逆行胰膽管注射3%?；悄懰徕c建立SAP模型, C組則注射生理鹽水（NS）。SAP組和C組術后行陰莖背靜脈注射NS；A組、B組和AB組如SAP組一樣建立模型，術后分別注射丹參、氫化可的松、丹參加氫化可的松。18 h后，觀察各組胰腺細胞IP3和細胞內鈣（Ca2+）、血清腫瘤壞死因子α（TNF-α）、血清鈣（血鈣）和淀粉酶（AMY），以及胰腺的病理改變。結果：SAP組IP3、Ca2+、TNF-α、AMY和胰腺病理評分（PSP）顯著高于A組、B組、AB組和C組（p＜0.05)，其中AB組明顯低于A組和B組（p＜0.05)，但A、B組間無明顯差異（p＞0.05）；C組的PSP明顯低于A組、B組和AB組（p＜0.05)，C組的IP3和Ca2+明顯低于AB組（p＜0.05)，AB組與C組的TNF-α間無明顯差異（p＞0.05）；IP3與Ca2+，IP3與TNF-α間呈明顯正相關（r分別為0.987和0.937，p＜0.05)；血鈣則是SAP組顯著低于A組、B組、AB組和C組（p＜0.05)， AB組和C組分別明顯高于A組和B組（p＜0.05），AB組顯著低于C組（p＜0.05），但A組與B組間無明顯差別（p＞0.05）。IP3、Ca2+和TNF-α與血鈣為負相關（r分別為-0.997、-0.980和-0.915，p＜0.05)。結論：SAP大鼠胰腺細胞IP3顯著升高； IP3與Ca2+和TNF-α水平呈明顯正相關，前三者與血鈣呈負相關， IP3可能是引起細胞內外鈣和TNF-α變化的重要原因之一；丹參和糖皮質激素均可抑制SAP大鼠胰腺細胞IP3和Ca2+及TNF-α的釋放，促進血鈣水平回升，胰腺組織病理損害減輕，聯合使用丹參和氫化可的松具有協同作用。

重癥急性胰腺炎；三磷酸肌醇；細胞內鈣；丹參；糖皮質激素

急性胰腺炎(acute pancreatitis,AP)是一種臨床常見的急腹癥，約25%的AP會發展為重型急性胰腺炎（severe acute pancreatitis, SAP）[1]。SAP發展迅速，并發癥多，死亡率高[2]。在SAP的早期和感染期，由SAP及其感染誘發的細胞因子瀑布樣釋放導致的重要器官損傷是SAP死亡的主要原因[2～3]。觀察發現，SAP時存在鈣超載，鈣超載可激活核因子-κβ及相關的炎癥因子，引起胰腺壞死[4～5]。1，4，5三磷酸肌醇（inositol 1 ,4 ,5- trisphosphate,IP3）是細胞內的第二信使，對細胞內鈣調控起著重要的作用[6]。丹參和糖皮質激素均用于治療SAP。然而SAP患者的IP3有何變化及其與鈣代謝的關系，以及丹參和糖皮質激素對這些變化有何影響，尚不清楚。本研究通過建立SAP動物模型，觀察SAP時胰腺細胞IP3的變化及其與鈣代謝的關系，以及丹參和糖皮質激素的影響，從細胞信號通路方面探討SAP發病及治療的機制。

1 材料與實驗動物

實驗動物：清潔級健康成年雄性SD大鼠50只，體重為200～250 g（購自第三軍醫大學實驗動物中心）。

試藥：牛磺膽酸（購自美國Sigma公司）；丹參注射液與氫化可的松（均購自貴州省人民醫院）；三磷酸肌醇ELISA試劑盒（北京尚柏生物有限公司）、AM Ester試劑盒（北京博雷德生物有限公司）、TNF-α ELISA試劑盒（重慶晶美生物工程有限公司）。

2 方法與結果

采用抓鬮的方式將50只大鼠隨機分為5組： SAP模型組（SAP組）、丹參治療組（A組）、氫化可的松治療組（ B組）、丹參加氫化可的松治療組（AB組）和對照組（C組）。每組10只。

2.2 實驗動物的處理

2.2.1 制模 各組動物于實驗前12 h禁食，自由飲水。采用乙醚持續吸入麻醉，按常規無菌方法作上腹正中切口入腹，參照Aho等[7]方法并改進復制SAP大鼠模型[8]。SAP組在開腹后用無創血管夾夾閉肝門部膽管，在相當于膽胰管開口處對側腸壁無血管區，用4.5號針穿刺腸壁，通過腸腔后逆行穿刺入膽胰管內1 cm, 以拇、食指壓迫封閉胰膽管遠端并固定穿刺針，推注3%?；悄懰? mL﹒kg-1, 推注速度為0.2 mL﹒min-1，壓力約20 cmH2O，術中即可見胰腺從胰管周圍開始充血、水腫。保持壓力并防止藥液逆流10 min后退出穿刺針，撤除肝門部血管夾，以5-0絲線縫扎關閉穿刺孔，逐層關腹完成建模；C組為按上述方法向膽胰管內逆行推注NS完成建模。

2.2.2 給藥 建模成功后，SAP組和C組關腹后立刻行陰莖背靜脈推注生理鹽水（normal sodium，NS）8 mL﹒kg-1，速度為0.5 mL﹒min-1。術后6 h再次乙醚麻醉按上述推注相同劑量的NS；A組、B組和AB組按上述相同時間、相同途徑兩次分別使用丹參注射液4 mL﹒kg-1、氫化可的松10 mg﹒kg-1、丹參注射液4 mL﹒kg-1和氫化可的松10 mg﹒kg-1，用NS稀釋藥物，用量為8 mL﹒kg-1。術后所有動物禁食，自由飲水。

2.2.3 取標本 各組動物于術后18 h乙醚麻醉后再開腹，自下腔靜脈采血約4 mL，3000 r﹒min-1離心15 min，各取血清約0.5 mL裝入2個EP管，置于-80 ℃冰箱內保存待批量檢測?？焖偾腥∫认俳M織塊，最大不超過0.5 mm x 0.8 mm，去除筋膜、血管等結締組織后，分裝入2個EP管置于-80 ℃冰箱內保存，余胰腺組織塊以10%甲醛溶液固定，并放入4 ℃冰箱內保存待批量檢測。所有動物均麻醉后放血死亡。

2.3 觀察指標

2.3.1 一般情況 如精神狀態、活動、反應、進飲及腹腔大體病理變化等。

2.3.2 胰腺組織IP3 將胰腺組織用電子天平稱重后放入0.01 M，PH7.2-7.4的PBS液(組織重量與PBS體積之比為1:10)，在冰浴條件下用超聲波分解器行超聲勻漿，勻漿液以3000 r﹒min-1離心15 min，收集上清液并參照大鼠三磷酸肌醇ELISA試劑盒使用說明書測定。2.3.3 胰腺細胞內鈣（Ca2+） 參照FLUO-3、AM Ester試劑盒說明書、鄧丕蘭等[9]的方法，將FLUO-3、AM Ester加入90 μL DMSO，均分裝為12管（暫未使用者放-80 ℃冰箱內保存），取1管加入無鈣PBS液1.5 mL配制成5 mmol﹒L-1液備用。加少量無鈣PBS液，用機械法剪碎胰腺組織，用孔徑500 μm的尼龍濾膜過濾后，以無鈣PBS 1 mL清洗，3000 r﹒min-1離心10 min，收集沉積物再洗滌、離心1次，再將第二次沉積物用適量無鈣PBS液稀釋調整為每毫升單個腺泡細胞數目為106的懸液（用臺盼藍染色檢查成活細胞在95%以上），與熒光劑反應后用流式細胞儀測定。

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2.3.4 血清腫瘤壞死因子α（TNF-α） 參照大鼠TNF-α ELISA試劑盒使用說明書測定。

2.3.5 血清淀粉酶（AMY）、血清鈣（血鈣） 各組血清標本均用全自動生化分析儀測定。

2.3.6 胰腺組織病理學檢查 各組取相同部位胰腺組織用10%中性甲醛液固定，石蠟包埋，連續5 μm切片后行HE染色，光鏡下觀察，參照 Kusske 標準[10]進行評分。

2.4 統計學處理

2.5 結果

2.5.1 一般情況 C組動物復蘇后一般情況良好，活動，反應敏捷，可進飲，無精神萎靡等現象。SAP組動物精神萎靡、蜷曲、不活動、反應差，不進飲。A組、B組和AB組動物一般情況較SAP組好，但較C組稍差。

2.5.2 各組動物胰腺IP3、Ca2+和TNF-α的變化 結果見表1，SAP組的胰腺IP3、胰腺Ca2+和TNF-α顯著高于A組、B組、AB組和C組（p＜0.05，AB組和C組明顯低于A組和B組（p＜0.05），A組與B組間無明顯差異（p＞0.05），其中C組的胰腺IP3和Ca2+明顯低于AB組（p＜0.05）。

表1 各組大鼠胰腺IP3、Ca2+和TNF-α的變化()

表1 各組大鼠胰腺IP3、Ca2+和TNF-α的變化()

注：▲與SAP組比較p＜0﹒05；★與A組和B組比較p＜0﹒05；●與AB組比較p＜0﹒05。

胰腺細胞內鈣 TNF-α(pg﹒mL-1)（只） (ng﹒mL-1) n 胰腺細胞內IP3組別SAP A B A B C 10 10 10 10 10 252.99±35.72 181.24±39.83▲183.78±42.84▲132.07±23.72▲★57.28±48.66▲★·10.63±2.38 7.00±0.55▲7.29±0.57▲4.40±1.81▲★2.50±1.04▲★·281.66±106.83 142.32±18.92▲138.31±20.73▲68.36±39.63▲★42.27±16.75▲★

2.5.3 各組動物血清AMY和血鈣的變化 結果見表2可見，SAP組的血清AMY顯著高于A組、B組、AB組和C組（p＜0.05），AB組和C組明顯低于A組和B組（p＜0.05），C組明顯低于A組、B組和AB組（p＜0.05），但A組與B組間無明顯差異（p＞0.05）。SAP組的血鈣顯著低于A組、B組、AB組和C組（p＜0.05），C組和AB組明顯高于A組、B組（p＜0.05），但A組與B組間無明顯差異（p＞0.05）。

表2 各組動物血清AMY和血鈣的變化()

表2 各組動物血清AMY和血鈣的變化()

注：▲與SAP組比較p＜0.05；★與A組和B組比較p＜0.05；·與AB組比較p＜0.05。

 組別 n（只） AMY(u) 血鈣（mmol﹒L-1）SAP A B AB C 10 10 10 10 10 5336.1±1937.83 2431.7±453.82▲2486.6±420.96▲1423.9±290.12▲★783.5±200.07▲★·2.51±0.11 2.69±0.07▲2.66±0.08▲2.83±0.08▲★3.04±0.15▲★·

2.5.4 各組動物胰腺細胞IP3與Ca2+、TNF-α及血鈣的關系 胰腺細胞IP3與Ca2+和TNF-α間呈明顯正相關，相關系數（r）分別為0.987、0.937和0.976（p＜0.05)。上述三者與血鈣呈顯著負相關， r分別為-0.997、-0.980和-0.915（p＜0.05)。結果見圖1。

圖1 5組動物胰腺內IP3、胞內鈣、TNF-α和血鈣間對數值變化

2.5.5 腹腔和胰腺組織病理改變 C組大鼠的腹腔、胃腸和胰腺及胰周圍無明顯改變。SAP組大鼠的腹腔內有大量血性腹水，胃腸顯著擴張，胰腺大片出血、壞死，大量中性粒細胞浸潤和小葉出血，胰腺表面、大網膜、腸系膜等可見大量皂化斑。A組、B組和AB組大鼠可見少量淡血性腹水，胃腸輕度擴張，胰腺以充血、水腫為多見，有少量中性粒細胞浸潤，偶見點狀出血、壞死和皂化斑等。胰腺病理評分，SAP組評分（11.1±0.88）顯著高于A組(9.2±0.45)、B組(8.6±1.82)、AB組(7.5±1.08)和C組(6.4±1.07，p＜0.05)，C組明顯低于A組、B組和AB組（p＜0.05)，AB組明顯低于A組（p＜0.05)，但與B組間無明顯差異（p＞0.05），A組與B組間無明顯差異（p＞0.05）。

3 討論

3.1 SAP胰腺細胞IP3和Ca2+、血鈣及TNF-α的變化及其相互關系

在乙酰膽堿等刺激下，細胞膜IP3生成后，從膜上擴散至胞漿中并與內質網上的受體（即實際上的Ca2+通道）結合，使IP3操縱的鈣通道活化、大量開放，大量Ca2+從鈣庫內迅速釋放，造成胞漿內Ca2+濃度急劇升高[11]。胞漿內Ca2+又可作為細胞內第二信使，激活鈣庫膜上的受體，使鈣庫排鈣，出現“鈣誘發的鈣釋放”（calcium induced calcium release, CICR)現象[12～13]。隨著鈣庫鈣的釋放，繼而細胞膜上操縱Ca2+通道的開放，引起充電式Ca2+內流，促進細胞外Ca2+向細胞內轉移[12,14～16]。因此IP3是細胞內鈣信號相關的第二信使，其與相應受體結合可以調控細胞內鈣釋放。觀察顯示，AP時存在細胞內鈣超載[4]。本研究發現，SAP時胰腺細胞IP3明顯高于對照組，相應地細胞內鈣亦顯著高于對照組，呈明顯正相關(r=0.987)，而血鈣卻明顯降低，表現為負相關(r=-0.997)，提示SAP時存在細胞IP3的異常，從而導致鈣代謝異常，即細胞內鈣釋放致細胞內鈣水平上升，細胞外鈣向細胞內轉移致細胞外鈣水平下降；SAP時出現的鈣超載其重要原因之一是細胞內IP3出現異常所致。

較多研究指出，AP發生后，炎癥細胞產生過量的TNF-α，一方面其可引起胰腺細胞壞死，另一方面其迅速進入血液循環，促進其他細胞因子的產生，引起細胞因子級聯反應，導致全身炎癥反應綜合征（Systemic infammatory response syndrome,SIRS ）和多器官功能障礙綜合征（Multiple organ dysfunction syndrome,MODS）[17～18]。AP時存在細胞內鈣超載[4],臨床使用鈣拮抗劑異搏定治療AP，可使血清TNF-α明顯降低[19]，提示鈣超載與TNF-α有關。本研究結果顯示，SAP組血清TNF–α水平顯著高于對照組，并與細胞IP3和Ca2+水平呈正相關（r分別為0.937和0.976），SAP組的胰腺病理評分明顯高于對照組，說明SAP時TNF–α的增高與細胞IP3升高誘發的細胞內鈣超載相關。

3.2 丹參和糖皮質激素對SAP胰腺細胞IP3、Ca2+、血鈣及TNF-α的影響

臨床上使用丹參可抑制SAP時TNF-α分泌[15]。本實驗結果發現丹參治療SAP后，細胞IP3水平明顯降低，Ca2+濃度顯著下降，與此同時血鈣顯著回升，TNF-α明顯下降，血AMY水平及胰腺組織病理評分均有明顯改善，提示丹參對AP的治療作用可能是通過降低細胞IP3水平，依次進而降低Ca2+及其TNF-α水平而實現的。

糖皮質激素具有抑制炎癥介質、清除自由基和改善微循環等作用。有實驗應用甲基強的松龍可使SAP時TNF-α的高水平和血鈣下降水平均得以改善[17～18]。本研究中應用氫化可的松后，細胞IP3、Ca2+和TNF-α明顯下降, 相應地AMY和胰腺病理評分均顯著降低，而血鈣顯著回升，表明糖皮質激素對AP有一定治療作用，其機制之一可能是首先降低細胞IP3，減少鈣超載，從而抑制TNF-α釋放。

在本研究中，當聯合使用丹參和糖皮質激素治療SAP后，細胞IP3、Ca2+、TNF-α、AMY、胰腺病理評分均比SAP組顯著下降，比單獨使用丹參或糖皮質激素有不同程度降低，其中Ca2+顯著下降，血鈣明顯恢復，胰腺病理評分和AMY顯著降低，提示聯合使用丹參和糖皮質激素有協同作用，比單用效果好。研究還發現，不管單獨使用丹參或糖皮質激素，還是二者聯合使用，細胞內IP3雖然明顯下降，但仍然明顯高于對照組，其原因可能與實驗觀察時間過短等有關，有待進一步研究。

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(責任編輯：何瑤)

Infuence of Danshen and glucocorticoid on inositol triphosphate and calcium metabolism in rats with severe acute pancreatitis

WANG Hang, SHI Cheng-xian//( 1. Sixth People's Hospital of Chongqing, Chongqing 400060; 2. Guizhou Provincial People’s Hospital Guiyang 550002, Guizhou)

Objective:To investigate the changes of inositol triphosphate (IP3) and the relation between the IP3 and calcium metabolism，and the effect of Danshen and glucocorticoid on the change in rats with severe acute pancreatitis(SAP).Method:Fifty Sprague-Dawley rats were randomly divided into fve groups: severe acute Pancreatitis group (group SAP), treatment group of Danshen (group A), treatment group of dermacort (group B), Danshen and dermacort treatment group (group AB), and control group (group C). The model of SAP was induced by 3% Sodium Taurocholate. After operation, normal sodium (NS) was injected by vena in group SAP and C. However the group C was ham operation. The model of group A, B and AB were established as group SAP. But Danshen were administered in group A and dermacort in group B, the integrated Danshen and dermacort were used in group AB. Serum amylase(AMY), calcium and tumor necrosis factor α(TNF-α) were examined. Intracellular IP3 and Ca2+, and histological change and pathological scores of pancreas （PSP）were observed after 18 h.Result:The IP3，Ca2+，TNF-α，AMY and PSP in group SAP were signifcantly higher than those in group A，group B，group AB and group C（p＜0.05). And those in group AB were significantly lower than those in group A and group B（p＜0.05)，but there were not signifcantly different between group A and group B( p＞0.05).The PSP in group C were signifcantly lower than those in group A，group B and group AB（p＜0.05), but the IP3 and Ca2+in group C were signifcantly lower than those in group AB. There were not signifcantly different of TNF-α between group AB and group C. The IP3 of pancreas was positive correlation with Ca2+and TNF-α and negative relation with the serum calcium in SAP（r = 0.987, r = 0.937, p＜0.05). Serum calcium in group SAP were significantly lower than those in group A，group B，group AB and group C（p＜0.05), however that in group AB and group C were signifcantly higher than those in group A group B. Serum calcium in group AB was signifcantly lower than those in group C, but there were not signifcantly different between group A and group B. IP3, Ca2+and TNF-α were negative related with the serum calcium in SAP (r=-0.997、-0.980和-0.915，p＜0.05).Conclusion:There are signifcantly increase of the pancreatic cell IP3, and the increase of IP3 is positive related with the Ca2+and TNF-α. And IP3, Ca2+and TNF-α are negative related withthe serum calcium in SAP. It show that the IP3 is a main factor inducing abnormity of calcium metabolism in SAP. Danshen and glucocorticoid may respectively restrain the release of IP3, however the effects of both medicine integration is better than single medicine.

Severe acute pancreatitis; inositol triphosphate (IP3); intracellular calcium (Ca2+); Danshen; glucocorticoid;

R 283

A

1674-926X(2014)03-007-04

貴州省優秀人才基金資助項目(20060-36)

1. 重慶市第六人民醫院，重慶 400060 2. 貴州省人民醫院，貴州 貴陽 550002

王行，男Email:wanghang751115@163.com

石承先，男，教授，博士生導師

2013-11-01