地塞米松早期干預對犬胸部開放傷海水浸泡所致急性肺損傷的治療作用及機制探討

李 毅，段蘊鈾，韓志海，劉于紅

(北京海軍總醫院，北京100048)

李輝等［1］研究證實，海水浸泡胸部開放傷可導致嚴重的急性肺損傷(ALI)，最終發展為多器官功能衰竭。ALI的本質是全身炎癥反應在肺部的表現，主要特征是肺泡毛細血管損傷導致肺通透性增加，目前尚缺乏針對其發病機制有效的治療措施，病死率較高［2］。地塞米松是目前治療非心源性肺水腫的主要藥物，但其對于海水浸泡胸部開放傷所致ALI的作用尚缺少相關的實驗研究，治療價值尚無定論。2010年10～12月，我們觀察了地塞米松早期干預對胸部開放傷海水浸泡所致ALI的治療作用，現分析結果并探討其機制。

1 材料與方法

1.1 材料 健康成年雜交犬16只，購自北京科宇動物養殖中心(合格證號:SCXF-京-2008，普通級)，體質量10～15 kg，雌雄各半;隨機分為對照組和治療組各8只。地塞米松磷酸鈉(天津藥業焦作有限公司)，伊文思藍(上海恒源科技有限公司);血氣分析儀(OMNFC型，瑞士Roche)，血清型及組織型肺泡表面活性蛋白A(SP-A)、肺泡表面活性蛋白B(SP-B)試劑盒及SP-B抗體(Rapid Bio Lab，美國)。配方海水［3］(按照國家海洋局第三海洋研究所提供的我國東南沿海海水主要成分配制，滲透壓1 250～1 350 mmol/L，pH值8.20，比重1.05～1.06，溫度22℃)。

1.2 實驗方法

1.2.1 ALI模型建立及干預 對照組和治療組均制作ALI 術前禁食12 h，肌肉注射氯胺酮(20 mg/kg)麻醉，術中應用地西泮(安定)肌肉注射維持。右頸部、右胸部備皮。經口腔氣管插管，貼電極膜連接導線用于心電監護。分離右側頸靜脈及頸動脈置入單腔深靜脈穿刺管，用于抽取動靜脈血。用銳器于右胸第4肋間制成直徑為0.5 cm切口使胸膜腔與大氣相通，通過胸壁切口向胸腔內注入人工海水(35 mL/kg)，5 min內結束，然后封閉胸壁傷口。致傷30 min對照組于頸靜脈注射生理鹽水5 mL;治療組頸靜脈注射地塞米松1 mg/kg(加生理鹽水配制成5 mL)。所有犬在實驗6 h后給以放置胸腔閉式引流、靜脈輸入5%葡萄糖，繼續觀察4 h。

1.3 觀察項目

1.3.1 動脈血氣分析 分別于實驗0、6、8、10 h抽取動脈血檢測兩組動脈血氧分壓(PaO2)，計算氧合指數(PaO2/FiO2，FiO2取21%)。

1.3.2 血漿、支氣管肺泡灌洗液(BALF)中SP-A、SP-B水平 分別于致傷0、2、4、6、8、10 h采集靜脈血，離心后取上清－20℃保存;實驗10 h后行右下肺氣管鏡下肺泡灌洗，BALF離心后取上清－20℃保存。采用ELLS法檢測外周血和BALF中SP-A、SP-B含量。

1.3.4 血管外肺水含量指數(伊文思藍漏出指數，EVL-WI) 采用質量法。所有犬于實驗10 h后處死后，迅速開胸，結扎肺門;取下右上肺并剪成兩半(接扎切口防止液體流出)，各稱濕質量;一半肺即刻剪碎;按1 mL/100 mg組織加入生理鹽水勻漿，分別測血液和勻漿中Hb含量，剩余組織勻漿迅速置于－70℃保存備用;另一半肺置于80℃烘箱內干燥72 h至恒質量，稱肺干質量;計算公式:總肺水量指數(TLW)=(肺濕質量－肺干質量)/肺濕質量;每克濕肺含殘血量=(勻漿液Hb/血液Hb)×勻漿總樣本量×1.055/勻漿肺質量;濕肺含殘血量=肺濕質量×每克濕肺含殘血量，EVL-WI=(肺濕質量－肺干質量－濕肺含殘血量)/肺濕質量。

1.3.4 肺微血管通透性 用藥結束后經股靜脈注射1%伊文思藍20 mg/kg，20 min后抽血檢測血中Evans Blue含量。開胸取右肺上葉后經肺動脈插入的針頭，以等滲鹽水灌洗肺微血管至肺靜脈無血性液體流出為止，然后置于80℃烤箱72 h至恒質量，取少量干肺稱重，按3 mL/100 mg干肺加入甲酰胺，37℃孵育48 h，使藍染的標本退色。1 500 r/min離心5 min分離上清，上清及抗凝血分別置721分光光度計620 nm波長處比色，根據標準曲線獲得肺組織和血中伊文思藍含量。用伊文思藍漏出指數(ELI)表示肺微血管通透性。ELI=肺組織伊文思藍含量/(肺干重×血液伊文思藍含量)。

1.3.5 肺組織SP-B蛋白表達 采用免疫組化法。組織切片脫蠟，依次經3%過氧化氫溶液封閉，胃蛋白酶抗原修復，山羊血清封閉，逐步加入SP-B抗體及二抗，最后經DAB溶液顯色。胞質有棕黃色顆粒沉著為陽性細胞。每組隨機抽取染色清晰的切片3張，每張切片于光鏡下(×200)隨機選取5個視野，固定窗口面積，利用圖像分析系統軟件測定SP-B蛋白表達的灰度值。

1.4 統計學方法 采用SPSS16.0統計軟件，數據以s表示，兩組組間數據比較采用單因素方差分析或t檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 動脈血氣 致傷后出現急性呼吸窘迫表現，PaO2顯著降低，致傷6 h后兩組 PaO2/FiO2均 ＜300，符合ALI診斷標準。治療組在實驗第8、10 h PaO2明顯高于對照組(P均＜0.01)。見表1。

2.2 血清及BALF中SP-A、SP-B含量 治療組及對照組BALF中SP-A含量分別為24.076±6.845、16.201±7.687，P＜0.05;SP-B含量分別為31.785 ±8.576、19.472±6.865，P＜0.01。兩組不同時點血清SP-A、SP-B含量比較見表2。

表1 兩組動脈血PaO2及PaO2/FiO2變化(s)

表1 兩組動脈血PaO2及PaO2/FiO2變化(s)

注:兩組同一時間點比較，☆P＜0.01

組別 n PaO2(mmHg) PaO2/FiO2對照組8 0 h 90.4±5.6 430.5±26.8 6 h 57.4±6.2 273.4±29.6 8 h 65.4±5.1☆ 311.6±24.5☆10 h 63.5±6.9☆ 301.1±33.7☆治療組 8 0 h 88.9±3.6 423.4±17.2 6 h 55.7±2.7 265.3±13.6 8 h 74.5±4.8☆ 354.6±23.0☆10 h 76.8±8.2☆ 359.8±33.3☆

表2 兩組各時間點血清SP-A、SP-B含量(灰度值，s)

表2 兩組各時間點血清SP-A、SP-B含量(灰度值，s)

注:與對照組比較，☆P＜0.05;★P＜0.01

組別 n SP-A SP-B對照組8 0 h 20.883±3.755 20.863±5.025 2 h 22.872±4.112 22.020±3.734 4 h 29.981±3.538 24.488±3.550 6 h 35.905±9.622 33.761±8.054☆8 h 40.535±7.994☆ 36.021±7.980☆10 h 43.483±8.069★ 36.686±4.614★治療組 8 0 h 21.308±3.312 18.423±5.241 2 h 23.321±2.719 21.443±4.150 4 h 26.809±1.992 22.634±4.784 6 h 30.102±3.089 26.386±2.198☆8 h 32.168±2.926☆ 28.186±3.913☆10 h 33.677±4.643★ 27.146±4.640★

2.3 EVL-WI及ELI治療組及對照組EVL-WI分別為0.502±0.074和0.601±0.814，P＜0.05;ELI分別為0.212±0.059、0.399±0.081，P＜0.01。

2.4 肺組織SP-B蛋白表達 與治療組比較，對照組肺內陽性Ⅱ型肺泡上皮細胞數量明顯減少，棕黃色染色變淺，SP-B蛋白表達減弱。對照組及治療組SP-B蛋白表達分別為13 264.964±2 386.421，37 525.401±2 814.235，P＜0.05。

3 討論

對于淹溺后早期使用糖皮質激素的益處已有所報道［4］。丁新民等［5，6］的研究也表明糖皮質激素在海水淹溺致急性肺損傷中可以明顯改善淹溺兔的缺氧及肺水腫狀態，并抑制兔肺組織的炎癥反應。但地塞米松對胸部開放傷后海水浸泡致ALI的作用尚未見報道。與一般ALI的不同，胸部開放傷后海水浸泡致ALI除了會出現嚴重的低氧血癥外，還會引起電解質紊亂、高滲性脫水、酸中毒等多種病理生理改變，引發全身炎癥反應，最后出現多器官功能衰竭［7，8］。地塞米松作為一種簡單、有效的抗炎藥物，研究其在胸部開放傷后海水浸泡致ALI中的作用具有重要意義。

PS系統存在于正常肺泡表面，由肺泡Ⅱ型上皮細胞產生。正常情況下，PS由較多脂質及少量蛋白質構成。PS中的蛋白質成分又稱為表面活性物質相關蛋白(SP)，包括A、B、C、D四種成分，主要以大聚集體的形式存在。在正常的肺呼吸過程中，作為存在于肺泡液氣界面的一種媒介，PS可降低肺泡的表面張力，維持大小肺泡的相對穩定，防止小肺泡萎陷及大肺泡的過度膨脹;對于維持肺內正常的通氣血流比值和正常肺換氣起著非常重要的作用;而SP-A、SP-B對于PS有重要的調控作用。SP-A通過分子間糖和植物血凝素結合位點的相互作用而聚合磷脂，對管狀髓磷脂和多板層體的形成具有重要作用;SP-A尚有拮抗血漿蛋白對PS滅活的作用及參與肺內局部免疫和炎癥反應的調節作用。Greene等［9］在發生ARDS高危患者BALF中發現SP-A明顯下降，SP-A異常低下者均發展成為ARDS;相反其濃度高于1.2 mg/mL者均未發展成ARDS。SP-B則直接參與肺表面張力的降低，促進磷脂在氣液界面的吸附和擴張，是SP發揮作用的關鍵［10，11］。本研究治療組肺泡內SP-A、SP-B含量明顯高于對照組，而血清內 SP-A、SP-B含量明顯減少，治療組PaO2和PaO2/FiO2也明顯高于對照組，說明SP-A、SP-B對于維持肺泡通氣，提高PaO2和PaO2/FiO2有著重要作用。

肺水腫時，血漿蛋白(如白蛋白、纖維蛋白原、纖維蛋白單體、血紅蛋白等)及細胞脂質(如膽固醇、流體膜磷脂、溶血磷脂、甘油脂等)滲出進入肺泡腔，能與PS在氣液界面競爭，干擾PS單分子層的形成而抑制其表面活性，這是成人呼吸窘迫綜合征發病機理中的重要因素之一，也是目前使用外源性PS替代治療所急待解決的關鍵問題之一［12］。糖皮質激素能有效的減輕肺毛細血管的滲漏，一方面提高肺泡內SP的濃度;另一方面可阻止血漿蛋白向肺泡內滲漏，避免SP功能的喪失。上述兩方面作用可有效保存SP的數量和功能，增加肺復張后有效的肺泡通氣面積，從而改善犬的缺氧狀況。本研究顯示在海水浸泡致急性肺損傷的6 h內，對照組和治療組PaO2/FiO2均低于300，經救治后均有明顯改善，但治療組改善效果明顯優于對照組;對EVL-WI和ELI的檢測結果顯示，地塞米松可明顯減輕犬肺水腫及毛細血管漏出。

總之，早期應用地塞米松治療胸部開放傷后海水浸泡致ALI可改善缺氧和減輕肺水腫，改善缺氧的機制部分與地塞米松維持了肺泡內SP的數量和功能等因素相關。

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