蘇云金芽孢桿菌原生質體制備與再生研究

宋利丹　鄭毅　周勇

摘 要：主要研究了菌齡、酶濃度、酶解時間和酶解溫度對蘇云金芽孢桿菌原生質體制備和再生的影響。通過正交試驗確定了蘇云金芽孢桿菌制備和再生的最佳條件，當酶濃度為1.0mg/mL，酶解時間為80min，酶解溫度為30℃時，原生質體的制備率和再生率達到最高，分別為98.14%和58.14%。

關鍵詞：蘇云金芽孢桿菌；原生質體；制備；再生

中圖分類號 S476.1 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2014）03-04-20-02

引言

基因組改組技術是近幾年迅速發展的微生物育種技術，在菌種特性改良和提高產量等方面取得了一系列成果[1]。原生質體制備、再生與融合技術是基因組改組育種的重要技術基礎，由于各種微生物細胞壁的組成和結構不同，不同菌種原生質體制備和再生的條件也不相同[2-3]，較高的原生質體制備率和再生率是育種成功的必要條件。本研究擬開展蘇云金芽孢桿菌基因組改組菌種選育，通過酶解法制備蘇云金芽孢桿菌原生質體，主要研究了菌齡、酶濃度、酶解時間、酶解溫度對原生質體制備和再生的影響，優化出原生質體制備與再生的最佳條件，為進一步進行原生質體的融合、選育優良重組的菌株奠定基礎。

1 材料

1.1 菌種 蘇云金芽孢桿菌FS42，本實驗室保藏。

1.2 培養基 （1）斜面（平板）培養基（g/L）：牛肉浸膏3，蛋白胨10，氯化鈉5，瓊脂20。pH7.0～7.2。

（2）再生培養基（g/L）：牛肉浸膏3，蛋白胨10，氯化鈉5，瓊脂20，蔗糖171.15。pH7.0～7.2。

（3）種子培養液（g/L）：牛肉浸膏3，蛋白胨10，氯化鈉5。pH7.0～7.2。

2 方法

2.1 菌種活化 從保種斜面挑取一環，平板劃線，37℃恒溫培養箱放置24h。

2.2 種子培養 從活化的平板上挑取成熟的單菌落接入種子培養基（裝液量50mL/250mL三角瓶），置于 30℃ 230r/min恒溫搖床振蕩培養11h。

2.3 原生質體制備與再生

2.3.1 原生質體的制備 （1）挑取成熟的單菌落接入液體培養基（裝液量50mL/250mL三角瓶），置于30℃ 230r/min恒溫搖床振蕩培養11h，2%轉接新鮮的液體培養基（裝液量50mL/250mL三角瓶），恒溫搖床振蕩培養3h，加3%的甘氨酸，繼續培養4h。（2）吸取3mL菌液，加入3mL0.75mg/mL溶菌酶液，40℃水浴低速振蕩60min。（3）吸取0.1mL菌液，用無菌水稀釋至一定梯度，吸取0.1mL涂于平板上，37℃培養24h，計算其菌落數（A值）。

2.3.2 原生質體的再生 （1）用高滲緩沖液將制備好的原生質體懸液稀釋至一定梯度，吸取0.lmL涂于再生培養基，37℃培養24h，計算其菌落數（C值）。（2）吸取0.1mL制備好的原生質體懸液，用無菌水稀釋至一定梯度，靜置20min，使其充分脹破，最后吸取0.1mL涂于平板上，37℃培養24h，計算其菌落數（B值）。

2.3.3 制備率和再生率計算公式 （1）制備率（%）=（A-B）/A×100；（2）再生率（%）=（C-B）/（A-B）×100。其中，A：總菌落數；B：未被酶解的菌數；C：原生質體再生菌數與未酶解菌總數。

3 結果與分析

3.1 單因素試驗優化

3.1.1 溶菌酶濃度對原生質體制備與再生的影響 采用酶法制備蘇云金芽孢桿菌FS42原生質，取預培養的菌液（接后培養3h，加3%甘氨酸，繼續搖瓶培養4h），其它制備條件不變，溶菌酶濃度為0.5mg/mL、0.75mg/mL、1.0mg/mL，以考察不同濃度對原生質體制備與再生的影響，結果見圖1。

從圖1可以看出，當溶菌酶濃度為1.0mg/mL時，原生質體制備率達到最高，為82.63%，原生質體的制備率隨酶濃度的增加而升高，但提高幅度較緩慢。當溶菌酶濃度為0.5mg/mL時，再生率達到最高，而隨著酶濃度的增加，再生率逐漸下降，由12.1%下降至3.14%。由此可見，酶濃度的增加不利于原生質體的再生。雖然高濃度的酶制備率比較高，但再生率卻很低。其原因可能是高濃度的溶菌酶使細胞壁被裂解得太徹底，進一步對原生質體產生毒害，使其失去再生能力，從而再生率下降。

3.1.2 酶解時間對原生質體制備與再生的影響 采用0.5mg/mL溶菌酶酶解，其它制備條件不變，分別酶解作用40min、60min、80min，考察不同酶解時間對原生質體制備與再生的影響，結果見圖2。結果表明：酶解時間對其原生質體制備率和再生率有較大的影響。當酶解時間為60min，制備率與再生率的乘積達到最大，若繼續延長裂解的時間，雖然制備率有略微上升，但其再生率快速下降，造成這種結果可能是因為：原生質體的形成需要一定的酶解時間，酶解時間太短，則形成的數量少，直接影響其再生率；若時間太長，酶活力顯著下降且脫壁太徹底，使細胞壁失去再生的引物，對酶的損害也越大，使再生率大大降低[4]。

3.1.3 酶解溫度對原生質體制備與再生的影響

采用酶解時間為60min，其它條件不變，考察35℃、40℃、45℃ 3個酶解溫度對原生質體制備和再生的影響。由圖3可知，隨著溫度的升高，制備率逐漸升高，但變化較為緩慢，酶解溫度為45℃時，制備率達到最大，為99.76%。隨著溫度的升高，再生率逐漸下降。酶解溫度為35～40℃，雖然制備率變化緩慢，但對再生率的影響非常明顯，由17%下降至4.17%。根據酶的動力學性質可知，隨著溫度的升高，酶反應速度加快，但是酶反應的溫度過高，則會導致酶的失活，而降低酶解的能力，同時破壞了原生質體的活性，造成原生質體再生率顯著下降。

3.2 正交試驗優化原生質體制備與再生條件 單因素優化結果表明，酶濃度、酶解時間、酶解溫度對原生質制備與再生有重要影響，通過正交試驗考察3因素對原生質體制備與再生的綜合影響，采用3因素3水平試驗設計，結果見表1。以原生質制備率為考察指標，正交極差分析表明，酶解濃度在原生質體制備中起主導作用。當溫度為35℃、酶解濃度為1.0mg/mL、酶解時間為60min時，原生質體的制備率最高。以再生率為考察指標，正交極差分析表明，酶解溫度在原生質體再生中起主導作用。當溫度為30℃、酶解濃度為1.0mg/mL、酶解時間為80min時，原生質體的制備率均值最大，說明在這3個條件下，原生質體的制備效果最好。

綜合單因素與正交試驗可知，酶解濃度對原生質體制備影響最大，酶解溫度對原生質體再生的影響最大。根據正交試驗結果分析確定蘇云金芽孢桿菌原生質體制備與再生的最優條件為：取轉接后3h加甘氨酸，繼續搖瓶培養4h的菌體，在1.0mg/mL的溶菌酶溶液中，30℃酶解80min，此條件下，制備率達98.14%，同時再生率也可達58.14%。

參考文獻

[1]陳勁春，尉渤，周代福. 原生質體技術在工業微生物育種中的應用[J].工業微生物，1997（04）：37-39.

[2]李麒，武井直樹. 納豆在保健和醫療上的應用價值[J].中國微生態學雜志，2002（4）：57-60.

[3]劉新梅，高宇，趙靜，等.納豆菌原生質體制備與再生條件的研究[J].食品科學，2007（5）：231-236.

[4]劉伊強，王雅平，潘乃穟，等.芽孢桿菌原生質體的形成、再生及種間融合的研究[J].微生物學報，1994（1）：76-80.

[5]朱志春.基因組改組選育類球紅細菌輔酶Q10高產菌株[D].福建師范大學，2012.

[6]喬寶義，徐浩.棒狀桿菌原生質體的形成、再生以及融合的初步探討[J].微生物學報，1983（1）：33-43.

[7]雷虹，曾偉民，金忠斌，等.小白鏈霉菌（Streptomyces Albulus）的原生質體制備研究[J].黑龍江大學自然科學學報，2007（3）：306-309.

（責編：施婷婷）

摘 要：主要研究了菌齡、酶濃度、酶解時間和酶解溫度對蘇云金芽孢桿菌原生質體制備和再生的影響。通過正交試驗確定了蘇云金芽孢桿菌制備和再生的最佳條件，當酶濃度為1.0mg/mL，酶解時間為80min，酶解溫度為30℃時，原生質體的制備率和再生率達到最高，分別為98.14%和58.14%。

關鍵詞：蘇云金芽孢桿菌；原生質體；制備；再生

中圖分類號 S476.1 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2014）03-04-20-02

引言

基因組改組技術是近幾年迅速發展的微生物育種技術，在菌種特性改良和提高產量等方面取得了一系列成果[1]。原生質體制備、再生與融合技術是基因組改組育種的重要技術基礎，由于各種微生物細胞壁的組成和結構不同，不同菌種原生質體制備和再生的條件也不相同[2-3]，較高的原生質體制備率和再生率是育種成功的必要條件。本研究擬開展蘇云金芽孢桿菌基因組改組菌種選育，通過酶解法制備蘇云金芽孢桿菌原生質體，主要研究了菌齡、酶濃度、酶解時間、酶解溫度對原生質體制備和再生的影響，優化出原生質體制備與再生的最佳條件，為進一步進行原生質體的融合、選育優良重組的菌株奠定基礎。

1 材料

1.1 菌種 蘇云金芽孢桿菌FS42，本實驗室保藏。

1.2 培養基 （1）斜面（平板）培養基（g/L）：牛肉浸膏3，蛋白胨10，氯化鈉5，瓊脂20。pH7.0～7.2。

（2）再生培養基（g/L）：牛肉浸膏3，蛋白胨10，氯化鈉5，瓊脂20，蔗糖171.15。pH7.0～7.2。

（3）種子培養液（g/L）：牛肉浸膏3，蛋白胨10，氯化鈉5。pH7.0～7.2。

2 方法

2.1 菌種活化 從保種斜面挑取一環，平板劃線，37℃恒溫培養箱放置24h。

2.2 種子培養 從活化的平板上挑取成熟的單菌落接入種子培養基（裝液量50mL/250mL三角瓶），置于 30℃ 230r/min恒溫搖床振蕩培養11h。

2.3 原生質體制備與再生

2.3.1 原生質體的制備 （1）挑取成熟的單菌落接入液體培養基（裝液量50mL/250mL三角瓶），置于30℃ 230r/min恒溫搖床振蕩培養11h，2%轉接新鮮的液體培養基（裝液量50mL/250mL三角瓶），恒溫搖床振蕩培養3h，加3%的甘氨酸，繼續培養4h。（2）吸取3mL菌液，加入3mL0.75mg/mL溶菌酶液，40℃水浴低速振蕩60min。（3）吸取0.1mL菌液，用無菌水稀釋至一定梯度，吸取0.1mL涂于平板上，37℃培養24h，計算其菌落數（A值）。

2.3.2 原生質體的再生 （1）用高滲緩沖液將制備好的原生質體懸液稀釋至一定梯度，吸取0.lmL涂于再生培養基，37℃培養24h，計算其菌落數（C值）。（2）吸取0.1mL制備好的原生質體懸液，用無菌水稀釋至一定梯度，靜置20min，使其充分脹破，最后吸取0.1mL涂于平板上，37℃培養24h，計算其菌落數（B值）。

2.3.3 制備率和再生率計算公式 （1）制備率（%）=（A-B）/A×100；（2）再生率（%）=（C-B）/（A-B）×100。其中，A：總菌落數；B：未被酶解的菌數；C：原生質體再生菌數與未酶解菌總數。

3 結果與分析

3.1 單因素試驗優化

3.1.1 溶菌酶濃度對原生質體制備與再生的影響 采用酶法制備蘇云金芽孢桿菌FS42原生質，取預培養的菌液（接后培養3h，加3%甘氨酸，繼續搖瓶培養4h），其它制備條件不變，溶菌酶濃度為0.5mg/mL、0.75mg/mL、1.0mg/mL，以考察不同濃度對原生質體制備與再生的影響，結果見圖1。

從圖1可以看出，當溶菌酶濃度為1.0mg/mL時，原生質體制備率達到最高，為82.63%，原生質體的制備率隨酶濃度的增加而升高，但提高幅度較緩慢。當溶菌酶濃度為0.5mg/mL時，再生率達到最高，而隨著酶濃度的增加，再生率逐漸下降，由12.1%下降至3.14%。由此可見，酶濃度的增加不利于原生質體的再生。雖然高濃度的酶制備率比較高，但再生率卻很低。其原因可能是高濃度的溶菌酶使細胞壁被裂解得太徹底，進一步對原生質體產生毒害，使其失去再生能力，從而再生率下降。

3.1.2 酶解時間對原生質體制備與再生的影響 采用0.5mg/mL溶菌酶酶解，其它制備條件不變，分別酶解作用40min、60min、80min，考察不同酶解時間對原生質體制備與再生的影響，結果見圖2。結果表明：酶解時間對其原生質體制備率和再生率有較大的影響。當酶解時間為60min，制備率與再生率的乘積達到最大，若繼續延長裂解的時間，雖然制備率有略微上升，但其再生率快速下降，造成這種結果可能是因為：原生質體的形成需要一定的酶解時間，酶解時間太短，則形成的數量少，直接影響其再生率；若時間太長，酶活力顯著下降且脫壁太徹底，使細胞壁失去再生的引物，對酶的損害也越大，使再生率大大降低[4]。

3.1.3 酶解溫度對原生質體制備與再生的影響

采用酶解時間為60min，其它條件不變，考察35℃、40℃、45℃ 3個酶解溫度對原生質體制備和再生的影響。由圖3可知，隨著溫度的升高，制備率逐漸升高，但變化較為緩慢，酶解溫度為45℃時，制備率達到最大，為99.76%。隨著溫度的升高，再生率逐漸下降。酶解溫度為35～40℃，雖然制備率變化緩慢，但對再生率的影響非常明顯，由17%下降至4.17%。根據酶的動力學性質可知，隨著溫度的升高，酶反應速度加快，但是酶反應的溫度過高，則會導致酶的失活，而降低酶解的能力，同時破壞了原生質體的活性，造成原生質體再生率顯著下降。

3.2 正交試驗優化原生質體制備與再生條件 單因素優化結果表明，酶濃度、酶解時間、酶解溫度對原生質制備與再生有重要影響，通過正交試驗考察3因素對原生質體制備與再生的綜合影響，采用3因素3水平試驗設計，結果見表1。以原生質制備率為考察指標，正交極差分析表明，酶解濃度在原生質體制備中起主導作用。當溫度為35℃、酶解濃度為1.0mg/mL、酶解時間為60min時，原生質體的制備率最高。以再生率為考察指標，正交極差分析表明，酶解溫度在原生質體再生中起主導作用。當溫度為30℃、酶解濃度為1.0mg/mL、酶解時間為80min時，原生質體的制備率均值最大，說明在這3個條件下，原生質體的制備效果最好。

綜合單因素與正交試驗可知，酶解濃度對原生質體制備影響最大，酶解溫度對原生質體再生的影響最大。根據正交試驗結果分析確定蘇云金芽孢桿菌原生質體制備與再生的最優條件為：取轉接后3h加甘氨酸，繼續搖瓶培養4h的菌體，在1.0mg/mL的溶菌酶溶液中，30℃酶解80min，此條件下，制備率達98.14%，同時再生率也可達58.14%。

參考文獻

[1]陳勁春，尉渤，周代福. 原生質體技術在工業微生物育種中的應用[J].工業微生物，1997（04）：37-39.

[2]李麒，武井直樹. 納豆在保健和醫療上的應用價值[J].中國微生態學雜志，2002（4）：57-60.

[3]劉新梅，高宇，趙靜，等.納豆菌原生質體制備與再生條件的研究[J].食品科學，2007（5）：231-236.

[4]劉伊強，王雅平，潘乃穟，等.芽孢桿菌原生質體的形成、再生及種間融合的研究[J].微生物學報，1994（1）：76-80.

[5]朱志春.基因組改組選育類球紅細菌輔酶Q10高產菌株[D].福建師范大學，2012.

[6]喬寶義，徐浩.棒狀桿菌原生質體的形成、再生以及融合的初步探討[J].微生物學報，1983（1）：33-43.

[7]雷虹，曾偉民，金忠斌，等.小白鏈霉菌（Streptomyces Albulus）的原生質體制備研究[J].黑龍江大學自然科學學報，2007（3）：306-309.

（責編：施婷婷）

摘 要：主要研究了菌齡、酶濃度、酶解時間和酶解溫度對蘇云金芽孢桿菌原生質體制備和再生的影響。通過正交試驗確定了蘇云金芽孢桿菌制備和再生的最佳條件，當酶濃度為1.0mg/mL，酶解時間為80min，酶解溫度為30℃時，原生質體的制備率和再生率達到最高，分別為98.14%和58.14%。

關鍵詞：蘇云金芽孢桿菌；原生質體；制備；再生

中圖分類號 S476.1 文獻標識碼 A 文章編號 1007-7731（2014）03-04-20-02

引言

基因組改組技術是近幾年迅速發展的微生物育種技術，在菌種特性改良和提高產量等方面取得了一系列成果[1]。原生質體制備、再生與融合技術是基因組改組育種的重要技術基礎，由于各種微生物細胞壁的組成和結構不同，不同菌種原生質體制備和再生的條件也不相同[2-3]，較高的原生質體制備率和再生率是育種成功的必要條件。本研究擬開展蘇云金芽孢桿菌基因組改組菌種選育，通過酶解法制備蘇云金芽孢桿菌原生質體，主要研究了菌齡、酶濃度、酶解時間、酶解溫度對原生質體制備和再生的影響，優化出原生質體制備與再生的最佳條件，為進一步進行原生質體的融合、選育優良重組的菌株奠定基礎。

1 材料

1.1 菌種 蘇云金芽孢桿菌FS42，本實驗室保藏。

1.2 培養基 （1）斜面（平板）培養基（g/L）：牛肉浸膏3，蛋白胨10，氯化鈉5，瓊脂20。pH7.0～7.2。

（2）再生培養基（g/L）：牛肉浸膏3，蛋白胨10，氯化鈉5，瓊脂20，蔗糖171.15。pH7.0～7.2。

（3）種子培養液（g/L）：牛肉浸膏3，蛋白胨10，氯化鈉5。pH7.0～7.2。

2 方法

2.1 菌種活化 從保種斜面挑取一環，平板劃線，37℃恒溫培養箱放置24h。

2.2 種子培養 從活化的平板上挑取成熟的單菌落接入種子培養基（裝液量50mL/250mL三角瓶），置于 30℃ 230r/min恒溫搖床振蕩培養11h。

2.3 原生質體制備與再生

2.3.1 原生質體的制備 （1）挑取成熟的單菌落接入液體培養基（裝液量50mL/250mL三角瓶），置于30℃ 230r/min恒溫搖床振蕩培養11h，2%轉接新鮮的液體培養基（裝液量50mL/250mL三角瓶），恒溫搖床振蕩培養3h，加3%的甘氨酸，繼續培養4h。（2）吸取3mL菌液，加入3mL0.75mg/mL溶菌酶液，40℃水浴低速振蕩60min。（3）吸取0.1mL菌液，用無菌水稀釋至一定梯度，吸取0.1mL涂于平板上，37℃培養24h，計算其菌落數（A值）。

2.3.2 原生質體的再生 （1）用高滲緩沖液將制備好的原生質體懸液稀釋至一定梯度，吸取0.lmL涂于再生培養基，37℃培養24h，計算其菌落數（C值）。（2）吸取0.1mL制備好的原生質體懸液，用無菌水稀釋至一定梯度，靜置20min，使其充分脹破，最后吸取0.1mL涂于平板上，37℃培養24h，計算其菌落數（B值）。

2.3.3 制備率和再生率計算公式 （1）制備率（%）=（A-B）/A×100；（2）再生率（%）=（C-B）/（A-B）×100。其中，A：總菌落數；B：未被酶解的菌數；C：原生質體再生菌數與未酶解菌總數。

3 結果與分析

3.1 單因素試驗優化

3.1.1 溶菌酶濃度對原生質體制備與再生的影響 采用酶法制備蘇云金芽孢桿菌FS42原生質，取預培養的菌液（接后培養3h，加3%甘氨酸，繼續搖瓶培養4h），其它制備條件不變，溶菌酶濃度為0.5mg/mL、0.75mg/mL、1.0mg/mL，以考察不同濃度對原生質體制備與再生的影響，結果見圖1。

從圖1可以看出，當溶菌酶濃度為1.0mg/mL時，原生質體制備率達到最高，為82.63%，原生質體的制備率隨酶濃度的增加而升高，但提高幅度較緩慢。當溶菌酶濃度為0.5mg/mL時，再生率達到最高，而隨著酶濃度的增加，再生率逐漸下降，由12.1%下降至3.14%。由此可見，酶濃度的增加不利于原生質體的再生。雖然高濃度的酶制備率比較高，但再生率卻很低。其原因可能是高濃度的溶菌酶使細胞壁被裂解得太徹底，進一步對原生質體產生毒害，使其失去再生能力，從而再生率下降。

3.1.2 酶解時間對原生質體制備與再生的影響 采用0.5mg/mL溶菌酶酶解，其它制備條件不變，分別酶解作用40min、60min、80min，考察不同酶解時間對原生質體制備與再生的影響，結果見圖2。結果表明：酶解時間對其原生質體制備率和再生率有較大的影響。當酶解時間為60min，制備率與再生率的乘積達到最大，若繼續延長裂解的時間，雖然制備率有略微上升，但其再生率快速下降，造成這種結果可能是因為：原生質體的形成需要一定的酶解時間，酶解時間太短，則形成的數量少，直接影響其再生率；若時間太長，酶活力顯著下降且脫壁太徹底，使細胞壁失去再生的引物，對酶的損害也越大，使再生率大大降低[4]。

3.1.3 酶解溫度對原生質體制備與再生的影響

采用酶解時間為60min，其它條件不變，考察35℃、40℃、45℃ 3個酶解溫度對原生質體制備和再生的影響。由圖3可知，隨著溫度的升高，制備率逐漸升高，但變化較為緩慢，酶解溫度為45℃時，制備率達到最大，為99.76%。隨著溫度的升高，再生率逐漸下降。酶解溫度為35～40℃，雖然制備率變化緩慢，但對再生率的影響非常明顯，由17%下降至4.17%。根據酶的動力學性質可知，隨著溫度的升高，酶反應速度加快，但是酶反應的溫度過高，則會導致酶的失活，而降低酶解的能力，同時破壞了原生質體的活性，造成原生質體再生率顯著下降。

3.2 正交試驗優化原生質體制備與再生條件 單因素優化結果表明，酶濃度、酶解時間、酶解溫度對原生質制備與再生有重要影響，通過正交試驗考察3因素對原生質體制備與再生的綜合影響，采用3因素3水平試驗設計，結果見表1。以原生質制備率為考察指標，正交極差分析表明，酶解濃度在原生質體制備中起主導作用。當溫度為35℃、酶解濃度為1.0mg/mL、酶解時間為60min時，原生質體的制備率最高。以再生率為考察指標，正交極差分析表明，酶解溫度在原生質體再生中起主導作用。當溫度為30℃、酶解濃度為1.0mg/mL、酶解時間為80min時，原生質體的制備率均值最大，說明在這3個條件下，原生質體的制備效果最好。

綜合單因素與正交試驗可知，酶解濃度對原生質體制備影響最大，酶解溫度對原生質體再生的影響最大。根據正交試驗結果分析確定蘇云金芽孢桿菌原生質體制備與再生的最優條件為：取轉接后3h加甘氨酸，繼續搖瓶培養4h的菌體，在1.0mg/mL的溶菌酶溶液中，30℃酶解80min，此條件下，制備率達98.14%，同時再生率也可達58.14%。

參考文獻

[1]陳勁春，尉渤，周代福. 原生質體技術在工業微生物育種中的應用[J].工業微生物，1997（04）：37-39.

[2]李麒，武井直樹. 納豆在保健和醫療上的應用價值[J].中國微生態學雜志，2002（4）：57-60.

[3]劉新梅，高宇，趙靜，等.納豆菌原生質體制備與再生條件的研究[J].食品科學，2007（5）：231-236.

[4]劉伊強，王雅平，潘乃穟，等.芽孢桿菌原生質體的形成、再生及種間融合的研究[J].微生物學報，1994（1）：76-80.

[5]朱志春.基因組改組選育類球紅細菌輔酶Q10高產菌株[D].福建師范大學，2012.

[6]喬寶義，徐浩.棒狀桿菌原生質體的形成、再生以及融合的初步探討[J].微生物學報，1983（1）：33-43.

[7]雷虹，曾偉民，金忠斌，等.小白鏈霉菌（Streptomyces Albulus）的原生質體制備研究[J].黑龍江大學自然科學學報，2007（3）：306-309.

（責編：施婷婷）