蛋白質分子定向進化簡介

賴福春

【摘 要】定向進化是改進蛋白功能與活性的有效手段，主要是在實驗室里模擬自然進化過程，由易錯PCR、DNA改組、隨機引導重組和交錯延伸技術等方法進行誘變與突變基因體外重組，設計高通量篩選方法來選出需要的突變株。其對研究蛋白質的結構與功能的關系具有重大意義。本文綜述了定向進化技術的發展及應用。

【關鍵詞】定向進化；易錯PCR；DNA改組；篩選

在20世紀80年代建立起來的新興學科——蛋白質工程使人類可以根據已掌握的信息按照自己的意愿和需要改進蛋白質。蛋白質工程最初的目的是：通過對蛋白質分子結構的合理設計，再通過基因工程的手段，生產出具有更高生物活性或全新的、具有獨特活性的蛋白質。但是傳統的蛋白質工程方法（即合理設計）無法滿足對現有蛋白質進行分子改良的要求。面對這種情況，定向進化法逐漸受到重視。

蛋白質分子定向進化，屬于蛋白質的非理性設計，是蛋白質工程的新策略，是在試管中模擬達爾文進化的過程，利用分子生物學手段在分子水平創造分子的多樣性，結合靈敏的篩選技術，迅速得到理想的突變體。與合理設計相比，蛋白質定向進化在不清楚蛋白質結構的情況下，可以得到具有預期特性的新蛋白質。蛋白質定向進化是蛋白質工程的有效手段，其應用的領域逐漸擴大，遍及工、農、醫、食品等各方面。

一、定向進化的思想、概念和原理

1967年Spiegelman等最先提出分子水平上的體外定向進化思想，在隨后幾十年，通過各國生物學家和其他各界科學家的努力，這一思想轉變為現實，并融入到人類生產的領域。 定向進化是近20年發展起來的一項新技術，是達爾文的進化思想在核、肽或蛋白質等分子水平上的延伸和應用。蛋白質定向進化是人為地創造特殊的進化條件，模擬自然進化機制，在體外對蛋白質基因進行改造，產生基因多樣性，在結合定向篩選（或選擇）技術，獲得所需性能大幅提高的突變體。

定向進化是利用Taq-DNA聚合酶不具有3′→5′校對功能的性質，并結合基因工程現有技術手段，在待進化蛋白的PCR擴增反應中，配合適當條件，以很低的比率向目的基因中隨機引入突變，并構建突變庫。憑借定向的選擇方法，選出所需性質的突變體，從而排除其他突變體。定向進化的基本規則是：“獲取所篩選的突變體”。與自然進化不同，定向進化是人為制造特殊條件，模擬自然進化機制，使進化過程定向進行，整個進化過程完全是在人為控制下進行的，使蛋白質分子朝向人們期望的特定目標進化。

二、定向進化的基本方法

1.易錯PCR

Leung等人發明了該技術。易錯PCR（error-prone PCR）是一種簡便快速的在DNA序列中隨機制造突變的方法。其基本原理是通過改變傳統PCR反應體系中某些組分的濃度（如Mg2+的濃度）、調整4種dNTP的濃度或使用低保真度的Taq-DNA聚合酶等，使堿基在一定程度上隨機錯誤引入而創造序列多樣性文庫。

2.改組

DNA改組技術由美國人Stemmer于1994年提出。DNA改組（DNA shuffling）又稱有性PCR（sex-ual PCR），是將目的基因在DNase I的作用下隨機酶切成小片段，再通過PCR重組將這些小片段進行PCR反應，并重新組裝全長的基因。DNA改組過程中也可能引入新的點突變。因此，DNA改組可以有效地從單一基因系列開始進行蛋白質的定向進化。DNA改組克服了易錯PCR只能發生點突變而不能進行系列小區域間交換的缺點，大大提高進化效率。DNA改組被認為是繼DNA重組之后的又一代基因工程技術。

DNA改組有以下優點：（1）DNA改組可在短時間內通過重組有效的突變體發掘所有可能的重組體與突變序列，從而大大加快進化速度；而且對可操作的靶序列沒有任何要求，長度可以達到幾十kb；（2）通過多輪篩選或選擇，可以使有益突變迅速積累，導致功能的明顯提高；（3）DNA改組從表型上早期進行選擇，而不必了解DNA片斷上序列的信息，簡化了操作程序；（4）DNA改組比隨機突變顯著提高了良性突變的概率。

3.外顯子改組

外顯子改組（exon shuffling）類似于DNA改組，兩者都是在各自含突變的片段之間進行交換，它特別適合于真核生物，自然界中不同分子的外顯子發生同源重組，導致不同外顯子結合，是產生新蛋白的重要途徑之一。

4.隨機引發重組

1998年，Arnold提出了一種有效的新方法——隨機引發重組（RPR）。隨機引發重組的原理是：以單鏈DNA為模板，配合一套隨機引物先產生大量互補于模板不同位點的DNA小片段，由于堿基的錯配和錯誤引發，這些DNA小片段中會有少量的點突變，在DNA聚合酶作用下，經過反復的熱循環可重新組裝成全長基因克隆到表達載體上，隨后篩選。

5.交錯延伸技術

1998年，Arnold等人建立了一種新的體外重組方法——交錯延伸技術。交錯延伸是在PCR反應體系中把常規的退火和延伸合并為一步，在熱循環中大大縮短退火與Taq-DNA聚合酶催化延伸的時間。從而合成出短的新生鏈，在隨后反復進行變性和短暫復性、延伸過程，直到產生完整的基因長度，最終形成全長雜合基因突變庫。由于模板的轉換，大多數多核苷酸含有不同親本的序列信息。該方法的基因重組程度可通過控制反應條件和時間予以調節，僅需在一個反應管中進行，簡化了有性PCR操作。

6.酶法體外隨機-定位誘變

該方法是對目的基因采用隨機突變增加突變位點，以減少篩選突變體的工作量。它通過控制DNA合成底物種類和濃度比例實現堿基對的錯配。

7.定向進化的其他方法

近幾年，又相繼出現了一些定向進化的新方法，如臨時模板隨機嵌合技術、外顯子洗牌技術、SCRATCH技術、隨機插入/缺失突變、漸增切割法產生親和酶和酵母增強組合文庫。

需要說明的是：以上所表述的重組技術，任何一種都有缺陷。在實際應用中，應該針對具體的問題，選擇合適的技術，以達到最佳的效果。蛋白質分子定向進化技術在一定程度上彌補了定點突變技術的不足，極大地拓展了蛋白質工程學的研究和應用范圍，特別是能夠解決合理設計所不能解決的問題，為蛋白質的結構與功能研究開辟了嶄新的途徑，其對潛在的經濟、環境、社會和醫療的影響是不可預計的，并且蛋白質產品未來發展前景是無限的。相信在不久的將來，隨著定向進化技術與理性設計相結合，將極大地推進進蛋白質工程以及醫藥等領域的研究進展。

（作者單位：江西省信豐縣信豐中學）