褪黑素減輕蛛網膜下腔出血后的早期腦損傷

林 達，陳敬寅，李建儒，陳 高

顱內動脈瘤破裂所致的蛛網膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage，SAH)的發生率大約為1/10，000，具有高死亡率和高致殘率的特點［1］。最新的研究表明，蛛網膜下腔出血后的早期腦損傷(early brain injury，EBI)可能是導致蛛網膜下腔出血患者死亡率高的因素之一。其可能的機制包括腦血流量的降低、血腦屏障(blood-brain barrier，BBB)的破壞以及腦水腫［2］。

同時目前的研究也表明神經元細胞的凋亡也是早期腦損傷的一個重要因素并且是決定該疾病短期以及長期預后，特別是認知功能預后的一個重要因素［3，4］。因此，減輕蛛網膜下腔出血后的早期腦損傷可以有效地降低遲發的缺血性損傷的嚴重程度，改善蛛網膜下腔出血患者的神經預后。褪黑素(N-乙酰-5-氧基色胺)由松果體分泌，具有強烈的抗氧化作用，其可能的作用機制為褪黑素及其代謝物可以清除氧自由基，激活抗氧化酶，促進谷胱甘肽的合成，促進其他抗氧化劑的活化，并且可以保護抗氧化酶，所以是非常有效的抗氧化劑［5～8］。而且褪黑素能夠透過血腦屏障，即使大劑量應用也并未監測到毒性損傷［9，10］。盡管如此，褪黑素對蛛網膜下腔出血后早期腦損傷的作用仍沒有明確。

本研究擬觀察褪黑素是否能通過抑制細胞凋亡和穩定血腦屏障來減輕蛛網膜下腔出血后早期腦損傷和神經功能的改善。

1 實驗材料與方法

1.1 實驗動物和分組 體重300～330 g 的SD成年雄性大鼠購自Slac 動物實驗有限公司(中國上海)。大鼠隨機分為3 組，即假手術組(假手術+溶劑)、SAH 組(SAH+溶劑)、SAH+MEL 組(SAH+褪黑素)。這項研究所有的終點都設定在蛛網膜下腔出血模型建立后24 h。所有實驗的內容均得到了浙江大學實驗動物倫理委員會的批準。

1.2 大鼠蛛網膜下腔出血模型 我們依照文獻［11］介紹的方法建立大鼠的蛛網膜下腔出血模型。通過腹腔內注射戊巴比妥(40 mg/kg)對大鼠實施麻醉，快速暴露左側頸總動脈及其分支。從遠端切斷左側頸外動脈，使由此產生的斷端與頸內動脈成一直線。將一根鈍頭的4-0 單絲尼龍縫線通過頸外動脈斷端伸入頸內動脈，超過頸內頸外動脈分叉處約18～20 mm，直到有阻力感。繼續將單絲尼龍縫線推進約3 mm，即在靠近頸內動脈顱內分叉處刺穿頸內動脈。大約15 s 后退出單絲尼龍縫線。我們依據文獻公布的分級量表［12］來評價大鼠蛛網膜下腔出血的嚴重程度，對6 段基底池蛛網膜下腔的血液量做分級。0 分，沒有蛛網膜下腔出血;1 分，極少量蛛網膜下腔出血;2 分，中等量血并可見動脈;3分，血凝塊覆蓋了分段區域內的所有動脈。通過對6 個分段區域的分數相加可以得到該蛛網膜下腔出血模型的得分(0～18)。

1.3 藥物治療 褪黑素購自Sigma-Aldrich 公司(圣路易斯，密蘇里州，美國)。把褪黑素(150 mg/kg)溶解于含1%乙醇的生理鹽水溶劑中，在蛛網膜下腔出血2 h 后注射入SAH+MEL 組大鼠腹腔內。假手術組和SAH 組均在對應的相同時間點按體重注射等量的溶劑。

1.4 死亡率和神經功能障礙的評估 在蛛網膜下腔出血模型建立后24 h，進行死亡率和神經功能障礙評估。神經功能評分依據加西亞評分系統［13］。對大鼠的自發性活動、四肢活動的對稱性、前腳外伸、爬行、軀干本體感覺以及對觸須觸碰的反應進行觀察評定，每個測試計0～3 分或1～3 分，總分值范圍從3～18 分。所有測試分值的評定都由對分組及治療情況不知情的觀察者來完成，同時對動物行為測試的順序是隨機的。較低的得分表明存在嚴重的神經功能缺損。在同樣的時間點計算各組大鼠的死亡率。

1.5 腦含水量的測定 在蛛網膜下腔出血24 h后處死大鼠。立即取出腦組織并稱重得到濕的重量，然后在105 ℃情況下烘干24 h 后稱重得到干的重量。通過公式(濕的重量－干的重量)/濕的重量×100%計算得到腦組織的水含量［14］。

1.6 血腦屏障完整性的評價 在蛛網膜下腔出血模型建立后24 h，將2%伊文思藍(5 mg/kg)經左側股靜脈注入大鼠體內，并循環1 h。在深度麻醉后，用磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate-buffered saline，PBS)溶液經心室內灌注后取腦。將目標測定區域的腦組織稱重后浸潤在3 ml PBS 中制成勻漿，然后15000×g 下離心30 min。取0.7 ml 上液與等體積的三氯乙酸-乙醇(1∶3)混合液混合。經4 ℃下孵育過夜后，將樣品于15000×g 下離心30 min，并作激發光波長620 nm、發射光波長680 nm 的分光熒光測定。

1.7 組織學和TUNEL 染色 大鼠處死后用0.1 mmol 磷酸鹽緩沖溶液(pH 7.4)和4%多聚甲醛(pH 7.4)注入心臟。取腦放入相同的固定液，置于4 ℃環境中2 d。然后，將腦置于組織冷凍介質中冷凍，并切成7 μm 的切片。TUNEL 染色依據試劑生產廠家標明的方法進行，選取冠狀位相同位置的皮層切片，在400 倍熒光顯微鏡(LSM-710，Zeiss)下觀察拍照并測定相同大腦皮層區TUNEL 陽性(綠色)細胞數及細胞核(DAPI，藍色)數，取TUNEL 陽性細胞數所占細胞核數百分數統計分析。

1.8 蛋白質印跡 將大鼠處死后用pH 7.4 的PBS 作心內灌注，取左側基底皮質樣品(面對血塊)制成勻漿，在4 ℃下以1000×g 離心10 min。將所得上液進一步離心分離，使用CD 蛋白定量試劑(Bio-Rad)測定蛋白濃度。將等量的蛋白(60 μg)重懸于同樣的緩沖液中，95 ℃變性5 min，加入十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠作電泳分離。蛋白在80 V 電泳分離3 h 后，于100 V 經2 h，轉移到聚偏二氟乙烯膜上。膜經脫脂牛奶封閉后，加入檢測蛋白:一抗caspase-3(1∶1000，sc-22140，Santa Cruz Biotechnology)。膜經辣根過氧化物酶偶聯的二抗于21 ℃下孵育1 h 后，使用X 光膠片檢測蛋白條帶，并作定量分析(NIH)。

2 結果

2.1 生理學評價 在手術過程中監測的動脈壓、動脈血pH 值、p(O2)、p(CO2)、血糖水平間均沒有統計學差異(P＞0.05)(見表1)。

2.2 死亡率、神經功能障礙以及蛛網膜下腔出血分級 假手術組大鼠無死亡，SAH 組死亡率為12/35(33.3%);SAH+MEL 組死亡率為5/28(17.9%)。假手術組、SAH 組及SAH+MEL 組大鼠神經功能評分分別為17.8±0.4、10.9±0.7、12.3±1.2。SAH 組神經功能得分顯著低于假手術組(10.9±0.7 vs 17.8±0.4，P＜0.05)。SAH+MEL 組大鼠的神經功能缺損較SAH 組明顯減輕(12.3±1.2 vs 10.9±0.7，P＜0.05)。同時在取腦時發現蛛網膜下腔血凝塊主要分布在同側的Willis 環和腦干表面，假手術組、SAH 組和SAH+MEL組的蛛網膜下腔出血分級分數分別為(0±0)、(13.47±1.5)、(13.45±1.1)。SAH 組與SAH+MEL 組之間的蛛網膜下腔出血評分無顯著性差異。

2.3 褪黑素對腦含水量的影響 蛛網膜下腔出血后24 h，假手術組大鼠的腦含水量為79.2%;SAH 組大鼠的腦含水量為80.0%;SAH+MEL 組大鼠的腦含水量為79.5%。與假手術組相比，SAH 組的腦含水量增加0.8%(79.2% vs 80.0%，P＜0.05)。與SAH 組相比，SAH+MEL 組大鼠的腦含水量明顯降低(79.5% vs 80.0%，P＜0.05)。

2.4 褪黑素對血腦屏障的影響 伊文思藍染料外滲是血腦屏障破壞的一項指標。蛛網膜下腔出血后24 h，與假手術組相比，SAH 組大鼠的目標測定區域腦組織伊文思藍滲出明顯增多(P＜0.05)。與SAH 組相比，SAH+MEL 組大鼠目標測定區域腦組織伊文思藍滲出明顯減少(P＜0.05)。

2.5 褪黑素對細胞凋亡的影響 在假手術組沒有發現TUNEL 陽性細胞。蛛網膜下腔出血后24 h，SAH 組大鼠的基底部皮質可發現大量TUNEL陽性細胞。與SAH 組相比，褪黑素治療可以明顯減少基底部皮質中的TUNEL 陽性細胞(P＜0.05)。

2.6 褪黑素對caspase-3 表達的影響 我們在大鼠左腦基底部皮質中檢測caspase-3 的表達。褪黑素可以抑制蛛網膜下腔出血誘導的caspase-3 表達的升高。與SAH 組相比，SAH+MEL 組大鼠左腦基底部皮質中的caspase-3 表達水平明顯降低(P＜0.05)。

表1 不同組間生理狀態比較

3 討論

蛛網膜下腔出血早期腦損傷的機制非常復雜，涉及顱內壓的升高、腦灌注壓的降低、凋亡、壞死、自噬、血腦屏障障礙、氧化應激和炎癥等［15］。近期的研究發現，很多藥物在某一方面對蛛網膜下腔出血后早期腦損傷有保護作用，然而更多的研究表明，只有那些具有多重保護機制的藥物才能在近期和遠期預后中能起到較為切實有效的作用。在實驗中，我們研究了褪黑素在早期腦損傷中的作用，并且研究了它對蛛網膜下腔出血后大鼠腦組織細胞凋亡、血腦屏障功能障礙、腦水腫、神經功能障礙和死亡率的影響。我們的研究表明，在大鼠蛛網膜下腔出血2 h后腹腔注射褪黑素顯著改善了蛛網膜下腔出血后24 h時的預后，降低了大鼠的死亡率，改善了大鼠的神經功能評分。

在蛛網膜下腔出血的早期，通常可以觀察到血腦屏障的破壞、內皮細胞功能障礙以及隨后的腦水腫。而繼發于這些改變的便是顱內壓升高、嚴重的神經功能障礙和較高的死亡率［16，17］。在我們的研究中，我們在蛛網膜下腔出血后24 h 也發現了SAH 組大鼠存在腦水腫和血腦屏障破壞，但通過褪黑素治療可以減輕腦水腫和血腦屏障的破壞程度。

很多研究已經確定在動脈瘤蛛網膜下腔出血過程中，神經元、星形膠質細胞和少突膠質細胞都會發生凋亡［18，19］。我們的結果表明蛛網膜下腔出血后腦組織的相關區域凋亡水平上升，而通過褪黑素的治療可以降低其上升程度。另外，有證據表明外源性和內源性凋亡機制在蛛網膜下腔出血后的細胞凋亡過程中均被激活［20，21］，蛛網膜下腔出血后的細胞凋亡的分子機制主要涉及caspase-3、caspase-8 以及caspase-9，因而在蛛網膜下腔出血后抑制它們的活性對近期和遠期的預后均是有益的［11，22，23］。我們的研究表明蛛網膜下腔出血早期褪黑素治療可以降低caspase-3 的表達，從而降低蛛網膜下腔出血后的細胞凋亡水平，改善神經功能。

總之，我們的研究表明大鼠蛛網膜下腔出血后早期褪黑素治療有降低細胞凋亡水平、減輕腦水腫和保護血腦屏障的作用，并可能通過上述作用減輕蛛網膜下腔出血后的早期腦損傷，降低蛛網膜下腔出血的死亡率，改善神經功能。但是褪黑素降低細胞凋亡和保護血腦屏障的機制尚不明確，需要進一步的實驗去探索研究。

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