葛根提取物對阿爾茨海默病大鼠學習記憶能力的影響

何霞，季歐，李晉奇

·藥理毒理·

葛根提取物對阿爾茨海默病大鼠學習記憶能力的影響

何霞1，季歐2，李晉奇1

目的：觀察葛根提取物對阿爾茨海默病大鼠的學習記憶能力的影響。方法：Morris水迷宮篩選學習記憶正常SD大鼠72只，隨機分為假手術組12只，手術組60只，在腦定位儀定位下，手術組大鼠微量注射凝聚態β淀粉樣蛋白25-35（beta-amyloid peptide 25-35）至海馬內側腦室以建立阿爾茨海默病(AD)模型；假手術組注射等量生理鹽水。Morris水迷宮篩選模型成功大鼠，隨機分為模型組、0.42mg．kg-1多奈哌齊治療組、0.47g．kg-1、0.24g．kg-1、0.12g．kg-1葛根提取物治療組和假手術組，每組10只SD大鼠。治療組灌胃給藥，每日一次，連續四周；Morris水迷宮測試各組大鼠學習記憶能力。結果：(1)與假手術組比較，手術組大鼠學習記憶能力明顯降低（P＜0.01)。(2)與模型組相比，多奈哌齊組、0.47 g．kg-1．d-1、0.24 g．kg-1和0.12 g．kg-1．d-1葛根提取物組均可使大鼠的逃避潛伏期變短（P＜0.05，P＜0.01)，可使大鼠跨越平臺次數及在平臺象限游程百分比均增加（P＜0.05)。(3)各劑量組之間比較，于定位航行的第四、五天，大鼠逃避潛伏期差異明顯（P＜0.05)。結論：1.大鼠側腦室內注射Aβ25-35成功制備了大鼠AD模型。2.葛根提取物可改善AD大鼠的學習記憶能力，是否具有劑量依賴性，還需進一步研究。

阿爾茨海默病；葛根提取物；學習記憶能力；SD大鼠

阿爾茨海默病（Alzheimer Disease，AD）是一種以進行性記憶減退、認知功能障礙及精神異常為臨床表現的中樞神經系統退行性疾病。典型病理特征為海馬和大腦皮層內神經胞外淀粉樣β蛋白（β-amyloid, Aβ）沉積，形成老年斑（senile plaque, SP），T au蛋白異常聚集形成的神經纖維纏結（neurofibrillary tangles, NFTs）,以及腦皮層和海馬區神經細胞減少。目前，65歲以上老人AD患病率隨年齡增加而增長，2005年我國流行病學顯示，65歲以上老年人的癡呆患病率為7.8%，其中AD患病率為4.8%，且隨年齡增長而增加[1]。現AD已成為危害老年人的重要疾病之一，AD治療藥物的研究越來越多。

葛根（Radix Puerariae）為豆科植物野葛 Pueraria lobata（Willd.）Ohwi 的干燥根。其性涼，味甘、辛。具有解表退熱，生津，升陽止瀉等功效。用于外感發熱頭痛、高血壓頸項強痛、口渴、消渴、麻疹不透、熱痢、泄瀉等。《本草綱目》載：葛根，性涼、氣平、味甘，具清熱、降火、排毒諸功效。現代醫學研究表明，葛根中的異黃酮類化合物葛根素對高血壓、高血脂、高血糖和心腦血管疾病有一定療效。本實驗通過乙醇回流提取，得到葛根提取物，以研究其對AD大鼠學習記憶的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物 雄性6月齡SD（Sprage-Dawley）大鼠，體重180～220 g，購于四川省人民醫院實驗動物研究所。

1.1.2 主要實驗儀器 ELGA超純水系統(英國ELGA公司)；DNP-9052型電熱恒溫箱(上海精宏實驗設備有限公司)；ZH-藍星C型腦定位儀(淮北正華生物儀器設備有限公司)；ZH-RXZ型柔性顱骨鉆(淮北正華生物儀器設備有限公司)；微量進樣器(上海高鴿工貿有限公司，平頭，10毫升)；Morris水迷宮系統(成都泰盟科技有限公司)；MT-2000Morris水迷宮跟蹤分析系統（S7200）。

1.1.3 主要實驗藥物和試劑 葛根提取物（Puerarin extraction）：1g相當于原生藥31.98 g，四川省人民醫院藥學部藥研室制備；鹽酸多奈哌齊（Donepezil Hydrochloride）：5 mg/片，批號：091129A，國藥準字H20050978，衛才（中國）藥業有限公司；Aβ25-35：北京博奧森生物技術有限公司；戊巴比妥鈉：沃凱國藥集團化學試劑有限公司；苦味酸：臺山市眾誠化工有限公司，批號：20101101。

1.2 實驗方法

1.2.1 藥物配制 葛根提取物臨用時以溫開水分別配成濃度為4.7%、2.4%、1.2%的混懸液；鹽酸多奈哌齊臨用時以溫開水配成濃度為0.004%的混懸液，置于冰箱4℃保存備用。

1.2.2 給藥劑量的確定 鹽酸多奈哌齊成人劑量為5 mg．d-1。根據人和動物體表面積計算方法[2]，將鹽酸多奈哌齊轉換為大鼠等效劑量0.42 mg．kg-1．d-1。葛根提取物劑量根據最低中毒劑量換算，預計分為高、中、低三組，分別為0.47 g．kg-1．d-1、0.24 g．kg-1．d-1和0.12 g．kg-1．d-1。

1.2.3 給藥 用藥組分別按葛根提取物和鹽酸多奈哌齊灌胃給藥，模型組和假手術組灌胃給予等容量生理鹽水，每天一次連續給藥4周，各組大鼠在用藥期間自由飲水、進食。

1.2.4 Aβ25-35孵育 實驗前一周以生理鹽水將白色干粉Aβ25-35溶解為2μg/μl溶液，并置于37℃溫箱中孵育一周，使其變為具有神經毒性的凝聚狀態的Aβ25-35。

1.2.5 AD模型制備方法 大鼠用3%戊巴比妥鈉腹腔注射(30mg．kg-1)麻醉后，固定于腦立體定位儀上，俯臥位，頭部備皮，以碘伏消毒手術區皮膚后，沿顱部正中矢狀線劃開頭皮和骨膜，在用小棉球蘸取雙氧水輕輕涂擦骨面，充分暴露前囟位置。參照《大鼠腦立體定位圖譜》，選擇右側腦區(前囟向后1.0 mm，中線右旁2.0 mm，硬腦膜下4.0 mm)為注射靶區。用骨鉆鉆開顱骨，暴露硬腦膜，垂直進微量進樣針4.0 mm，將10 μg(2 μg/1 μg)聚集態的Aβ25-35溶液在5 min內緩慢注入，并留針10 min使溶液充分彌散,拔針5 min。縫合切口，于縫合處用0.1 mL慶大霉素注射液處理。保暖至清醒后，放回籠中常規飼養。假手術組以等量無菌生理鹽水代替Aβ25-35溶液，其余操作同上。所有操作均在相對無菌條件下進行。

1.2.6 Morris水迷宮測試 定位航行實驗（Place navigation test, PNT）:用于檢測動物在水迷宮的學習能力[3]。于大鼠最后一次灌胃給藥后一小時開始。每只大鼠用苦味酸在背部標記。每天分上、下午兩個時間段，每個時間段訓練4次，每次分別從3個不同的標記點將大鼠面向池壁放入水中，記錄120 s內尋找平臺所需時間（逃避潛伏期），每次至少間隔30 min，共訓練5天，平臺位置均保持不變。先將平臺置于東南象限中間，大鼠置于平臺上，20 s后從離平臺最遠的象限面向池壁將大鼠放入水中，記錄并觀察大鼠尋找平臺的路線和逃避潛伏期等。如果大鼠在120 s內未找到平臺，將其重新置于平臺20 s，后移出。

空間探索實驗（Spatial probe test, SPT）:用于檢測動物在水迷宮的空間記憶能力[3]。于第六天進行空間探索實驗。將平臺撤離，任選一個入水點將大鼠面向池壁放入水中，記錄大鼠在120 s內跨過虛擬平臺的次數及在平臺象限游泳距離占總游程的百分比。

1.3 統計方法

2 結果

2.1 AD模型建立判斷

水迷宮實驗的定位航行實驗中，各組大鼠逃避潛伏期隨著游泳天數的增加而下降，說明大鼠在五天的游泳訓練中尋找平臺有一定的學習記憶能力。在定位航行訓練的第五天，空白組大鼠逃避潛伏期為A（11.34±4.13）秒，手術組大鼠逃避潛伏期為B（50.64±2.42）秒，（B-A）/B%為74.66%，根據癡呆模型的判斷標準：（B-A）/B%＞20%，提示：大鼠雙側腦室注射小劑量Aβ25-35混懸液成功制備大鼠AD模型。

2.2 水迷宮檢測葛根提取物對大鼠學習能力的影響

2.2.1 定位航行實驗 從表1和圖1可見，各組大鼠逃避潛伏期隨著游泳天數的增加而不斷下降，說明各組大鼠定位航行的游泳訓練中對于平臺均有一定的學習記憶能力，但其學習記憶能力存在很大差異。第一、二天各組的潛伏期相比無統計學意義，從第三天到第五天，與假手術組相比，模型組大鼠逃避潛伏期顯著增加（P＜0.01）；與模型組相比，多奈哌齊組、0.47 g．kg-1．d-1、0.24 g．kg-1．d-1和0.12 g．kg-1．d-1葛根提取物組均可使大鼠的逃避潛伏期變短（P＜0.05，P＜0.01）；第四天，0.47 g．kg-1．d-1葛根提取物組與0.12 g．kg-1．d-1葛根提取物組之間差異明顯（P＜0.05），第五天，0.47 g．kg-1．d-1和0.24 g．kg-1．d-1葛根提取物組與0.12 g．kg-1．d-1葛根提取物組有差異（P＜0.05）。

表1 葛根提取物對大鼠逃避潛伏期的影響（，n=10）

表1 葛根提取物對大鼠逃避潛伏期的影響（，n=10）

與假手術組比較▲P ＜0.01；與模型組比較**P ＜0.01，*P ＜0.05；與0.12g．kg-1葛根總皂苷治療組比較?P＜0.05▲P ＜0.01υs sham operation group；**P ＜0.01，*P ＜0.05υs model group；?P＜0.05υs 0.12g．kg-1Puerarin extracttreatment group

逃避潛伏期(S)第一天 第二天 第三天 第四天 第五天假手術組 — 111.28±3.92 92.94±2.49 44.92±1.54 20.59±2.64 10.18±2.48模型組 — 115.24±5.69 98.08±1.88 64.33±2.85▲61.49±3.53▲50.94±2.42▲多奈哌齊 0.42mg．kg-1112.53±2.94 95.57±1.76 54.40±2.28*35.16±1.86**20.33±3.28**葛根總皂苷 0.12g．kg-1114.23±6.11 96.49±2.38 56.41±3.24*43.82±2.15**32.52±2.83**葛根總皂苷 0.24g．kg-1113.86±2.98 95.93±2.06 54.79±4.13*40.39±3.32**28.85±3.20**?葛根總皂苷 0.47g．kg-1111.81±3.14 94.39±2.62 50.60±2.61**34.30±2.46**?19.53±3.20**?組別 劑量

圖1 葛根提取物對大鼠逃避潛伏期的影響

2.2.2 空間探索實驗 從表2可見，與假手術組相比，模型組跨越平臺次數及在平臺象限游程百分比顯著下降（P＜0.01，P＜0.05）；與模型組相比，多奈哌齊組、0.47 g．kg-1．d-1、0.24 g．kg-1和0.12 g．kg-1．d-1葛根提取物組均可使大鼠跨越平臺次數及在平臺象限游程百分比均增加（P＜0.05）;葛根提取物三劑量組之間比較，大鼠跨越平臺次數和在平臺象限游程百分比差異較小，無統計學意義。

表2 葛根提取物對大鼠跨域平臺次數及平臺象限游程百分比的影響(，n=10)

表2 葛根提取物對大鼠跨域平臺次數及平臺象限游程百分比的影響(，n=10)

注：與假手術組比較▲P ＜0.01；與模型組比較*P ＜0.05▲P ＜0.01υs sham operation group；**P ＜0.01，*P ＜0.05υs model group

組別 劑量 跨越平臺次數 平臺象限游程百分比(次數／120S) （%）假手術組 —— 11.20±2.86 30.85±2.33模型組 —— 2.50±1.02▲16.04±1.65▲多奈哌齊組 0.42mg．kg-18.00±2.05*25.85±1.40**葛根提取物 0.47g．kg-18.80±1.25**23.42±2.12*葛根提取物 0.24g．kg-16.50±1.50**17.73±1.81葛根提取物 0.12g．kg-15.80±2.13 20.33±1.73

3 討論

3.1 AD模型建立及其可靠性

3.1.1 模型動物的選擇 近年來，隨著人口的老齡化，阿爾茨海默病越來越成為威脅人類的一種嚴重疾病，對于探討AD的發病機制及開放篩選有效防治AD疾病的藥物也越來越引起國內外學者的關注。人類疾病的研究，可通過動物模型的建立，來進行相關研究。目前動物模型采用的實驗動物有小鼠、大鼠、家兔和狗等。

本實驗選用的雄性SD大鼠，其具有多個優點。首先，大鼠在神經解剖方面與人類極為相似[5]，其腦血管解剖及海馬的結構與人類的結構有較高的相似度。其次，由于雌激素[6]可增強膽堿神經生長因子的敏感性，增強膽堿神經元的功能，改善AD患者的認知功能。為了更好地模擬AD的病理改變，減少性別差異對實驗結果的影響，本實驗選用雄性大鼠。最后，大鼠的生長繁殖能力較強，飼養管理方便，成本較低，能大批量應用統計，且大鼠生理、生化、藥理等方面的實驗已經資料較為豐富。因次，本實驗選用雄性SD大鼠做為模型動物。

3.1.2 AD模型評價 阿爾茨海默病的發病機制目前尚未完全明確，現有多種學說和假說，如遺傳學說、膽堿能假說、鉛中毒假說、淀粉樣蛋白級聯反應假說和Aβ沉積學說等。根據這些學說，模擬AD的動物模型方法大致分為損害模型、自然衰老模型、轉基因動物模型和Aβ動物模型。

實驗采用A β動物模型。阿爾茨海默病（Alzheimer disease, AD）最主要的病理特征之一是老年斑（SP）形成。β-淀粉樣蛋白是SP的核心成份。AD病人腦中SP的數量與癡呆的嚴重程度呈正相關。Aβ是由淀粉樣前體蛋(amyloid precursor protein，APP)分解而來的～種含39.43個氨基酸殘基的疏水肽，它包括多種活性片段，如Aβ25-35，Aβ1-40和Aβ1-42。腦內急性注射Aβ可使動物產生與AD相似的行為障礙和記憶缺損癥狀，并出現Aβ沉積。在AD中，Aβ的沉積存在一個惡性循環，即中樞膽堿能耗竭增加Aβ的產生和神經毒性，而Aβ又進一步削弱膽堿能神經傳遞的效應。凝聚狀態與可溶性的單體物質相比，前者對神經元的毒性更大[7]。故采用孵育一周后凝聚態Aβ25-35作為注射。

3.2 葛根提取物對AD大鼠學習記憶能力的改善

目前，測試學習記憶能力的方法主要有：Y-迷宮實驗、放射狀迷宮實驗、跳臺實驗、穿梭實驗、高架迷宮實驗、曠場實驗和Morris水迷宮實驗等。Morris水迷宮實驗是由Richard Morris在1984年設計用來測試實驗動物學習和記憶能力的一種模型[8]。它通過記錄動物入水后搜索水下平臺的時間和游泳游程，用于分析和推斷動物的學習、記憶和空間認知等方面的能力，它能較準確反映動物的空間學習和記憶能力，可作為測試實驗動物學習記憶水平的重要工具。

Morris水迷宮實驗包括定位航行實驗和空間探索實驗。（1）定位航行實驗：通過反復訓練，大鼠能夠利用周圍環境的空間線索對水下的平臺進行定位，以測定大鼠的學習能力，這種能力采用入水至爬上平臺的游泳路程，即逃避潛伏游程來表示。本研究結果發現：從第三天開始，與假手術組比較，模型組大鼠逃避潛伏期顯著增加，與模型組相比，多奈哌齊組、0.47 g．kg-1．d-1、0.24 g．kg-1．d-1和0.12 g．kg-1．d-1葛根提取物組均可使大鼠的逃避潛伏期變短，說明模型組在實驗期間學習能力有所下降，多奈哌齊組、0.47 g．kg-1．d-1、0.24 g．kg-1．d-1和0.12 g．kg-1．d-1葛根提取物組學習能力均明顯改善。第五天，0.47 g．kg-1．d-1和0.24 g．kg-1．d-1葛根提取物組與0.12 g．kg-1．d-1葛根提取物組有差異，但差異具有依賴性。逃避潛伏游程變化趨勢看，假手術組來越短，符合學習越來越快特點，模型組逃避潛伏游程上下波動，多奈哌齊組、0.47 g．kg-1．d-1、0.24 g．kg-1．d-1和0.12 g．kg-1．d-1葛根提取物組變化趨勢不如假手術組，但是優于模型組，推測可能是注射Aβ25-35造成海馬損傷，導致學習過程不穩定，而多奈哌齊組、0.47 g．kg-1．d-1、0.24 g．kg-1．d-1和0.12 g．kg-1．d-1葛根提取物組相對于模型組有所改善。（2）空間探索實驗：撤掉平臺，大鼠根據記憶對平臺的反復尋找，以測定大鼠的記憶能力。利用大鼠跨越平臺的次數和在原平臺象限游泳路程的百分比例來表示大鼠的記憶能力。實驗結果表明：與假手術組相比，模型組跨越平臺次數及在平臺象限游程百分比顯著下降，說明模型組的實驗期間記憶能力有所下降；與模型組相比，多奈哌齊組、0.47 g．kg-1．d-1、0.24 g．kg-1．d-1和0.12 g．kg-1．d-1葛根提取物組均可使大鼠跨越平臺次數及在平臺象限游程百分比均增加，說明多奈哌齊組、0.47 g．kg-1．d-1、0.24 g．kg-1．d-1和0.12 g．kg-1．d-1葛根提取物組在實驗期間記憶能力得到一定改善。

4 結論

4.1 大鼠側腦室內注射Aβ25-35成功制備了大鼠AD模型。

4.2 葛根提取物可改善AD大鼠的學習記憶能力，是否具有劑量依賴性，還需進一步研究。

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（責任編輯：蔣淼）

The pharmacological effect of Puerarin extract on learning and memory ability of rats with Alzheimer disease

HE Xia1, JI Ou2, LI Jin-qi1// (1.Department of Pharmacy, Sichuan Academy of Medical Sciences &Sichuan Provincial People’s Hospital, Chengdu 610072, Sichuan; 2 .Sichuan Orthopaedic Hospital, Chengdu 610041, Sichuan)

Objective:To investigate the effects of Puerarin extraction on the learning and memory ability in the rat model of Alzheime disease (AD). Method:72 normal SD rats were randomly divided into Sham-operated group (12 rats) and surgery group (60 rats) after being screened by Morris water maze method. 10 μg of beta-amyloid peptide 25-35（2 μg．μL-1）was injected into the lateral ventricle to establish AD rat model with stereotaxis instrument, and equivalent volume of saline was injected into sham operated group. Then the rats were randomly divided into sham operated group, AD model control group, 0.42 mg．kg-1Donepezil treated group, 0.47g．kg-1, 0.24g．kg-1, and 0.12g．kg-1Puerarin treated group (10 SD rats for each group). The rats of Donepezil treated group were intragastric administered with Donepezil daily, and 0.47g/kg, 0.24g/kg, and 0.12g/kg Puerarin treated group were intragastric administered with Puerarin extract once a day for 4 weeks. The Morris water maze was used to investigate the ability of learning and memory of rats. Result:(1) Compared with the sham-operated group, the learning and memory ability of the rats in operation groups were decreased signifcantly（P＜0.01). (2) Compared with the model group, 0.42 mg．kg-1Donepezil treated group, 0.4 7g．kg-1, 0.24 g．kg-1and 0.12 g．kg-1Puerarin extract treated group demonstrated shortened escape latency of rats（P＜0.05，P＜0.01), increased number of Crossing platform and run percentage of target quadrant（P＜0.05).(3)Compared among the Puerarin extract treated groups, there were signifcant differences in the escape latency of rats, in the fourth and ffth day of the navigation test(P＜0.05).Conclusion:(1) In this study, AD rat model is successfully established by injecting Aβ25-35 into lateral ventricle. (2) Puerarin extract can improve the learning and memory ability in the rat model of Alzheime disease, but urther study is still needed to explore the dose-dependent relationship.

R 285

A

1674-926X(2014)05-013-04

1. 四川省醫學科學院·四川省人民醫院，四川 成都 610072 2.四川省骨科醫院, 四川 成都 610041

何霞，女，碩士研究生，主管藥師，主要從事臨床藥理學和藥物基因組學的研究Tel:02887393405 Email:66280253@qq.com

李晉奇，男，博士，副研究員，主要從事藥理學研究 Tel:02887393316 Email:lijinqi2002@126.com

2014-03-03