腺苷預(yù)處理對大鼠腦缺血再灌注損傷后VEGF 的表達(dá)

尉 娜，王建平，申小龍，譚 軍

缺血性腦血管疾病是一類常見病、多發(fā)病，其致殘率與病死率都很高，極大地危害著人們的身體健康，而腦缺血同時也是多種腦損傷疾病共同的病理生理基礎(chǔ)，如何減輕腦缺血后的神經(jīng)損傷、提高腦組織對缺血的耐受，一直是臨床預(yù)防和治療缺血性腦血管疾病的重點(diǎn)和難點(diǎn)。腦缺血耐受的提出為防止腦缺血再灌注損傷開拓了新的研究領(lǐng)域，缺血預(yù)處理對大腦的保護(hù)作用對研究內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)機(jī)制和神經(jīng)保護(hù)治療方法提供了新的研究方向。然而在實(shí)際的臨床工作中在患者發(fā)生腦梗死之前對大腦進(jìn)行短暫的缺血預(yù)處理是不現(xiàn)實(shí)的，因此臨床工作中更多應(yīng)該選擇藥物進(jìn)行預(yù)處理，本實(shí)驗(yàn)中我們選用腺苷作為預(yù)處理的藥物。用腺苷進(jìn)行預(yù)處理后制備大腦中動脈腦缺血模型，再灌注后選擇不同時間點(diǎn)通過HE 染色后光鏡下觀察腦缺血再灌注損傷區(qū)域腦組織的病理變化，通過TTC 染色觀察腦梗死體積，運(yùn)用免疫組織化學(xué)法檢測血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)，探討腺苷預(yù)處理在腦缺血再灌注損傷中可能的保護(hù)機(jī)制，為臨床應(yīng)用腺苷預(yù)防和治療缺血性腦血管疾病提供理論依據(jù)，同時為減輕腦梗死損傷提供一條治療思路。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物及分組 健康SD 大鼠60 只(雄性，體重250～300 g)由新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動物中心提供。隨機(jī)分為假手術(shù)組(F 組)、缺血再灌注組(IR 組)、腺苷預(yù)處理組(AP 組)共3 組，這3 組根據(jù)再灌注時間隨機(jī)分為2 h、6 h、24 h、72 h 4 個亞組，每亞組5 只。F 組和IR 組大鼠于手術(shù)前3 d 開始腹腔注射生理鹽水，每天一次，每次2 ml;AP 組大鼠于手術(shù)前3 d 開始腹腔注射腺苷注射液，劑量為1.5 mg/kg，生理鹽水稀釋到2 ml，每天一次。

1.2 主要試劑 腺苷注射液(沈陽光大制藥有限公司，批準(zhǔn)文號為國藥準(zhǔn)字H20030320、規(guī)格為6 mg/2 ml);VEGF 多克隆抗體、即用型SABC 免疫組化試劑盒、DAB 顯色試劑盒(武漢博士德生物工程有限公司);Nikon MODEL YS100 顯微鏡(Nikon);照相顯微鏡HPIAS-2000 顯微圖像定量分析系統(tǒng)(鄭州太陽電子科技公司)。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 大鼠局灶性腦缺血再灌注模型的建立本實(shí)驗(yàn)采用尼龍線栓塞法制備大鼠大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion，MCAO)模型［1，2］，并加以改良。將SD 大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液(3 ml/kg)麻醉成功后，在頸正中線處縱向切開皮膚，分離右側(cè)頸總動脈(common carotid artery，CCA)，向近端分離出頸外動脈(external carotid artery，ECA)和頸內(nèi)動脈(internal carotid artery，ICA)。結(jié)扎并離斷ECA。ICA 分離至顱底，將其分支結(jié)扎離斷，僅保留ICA 入顱的主干通暢。用動脈夾暫時夾閉ICA 和CCA，在ECA 殘端剪一小口，插入準(zhǔn)備好的尼龍線，到達(dá)大腦中動脈(middle cerebral artery，MCA)的起始部，插入使其到達(dá)大腦前動脈(anterior cerebral artery，ACA)，進(jìn)入深度約18 mm，阻斷MCA 血流。在ECA殘端插線處打結(jié)固定尼龍線，打開動脈夾，將尼龍線尾端用黑色記號筆涂黑后留于皮膚外1 cm，消毒并逐層縫合。阻斷MCA 2 h 后，輕輕向外抽拉尼龍線至ECA 主干，使大腦動脈Willis 環(huán)和MCA 恢復(fù)血供，保持體溫至清醒。大鼠術(shù)后單籠飼養(yǎng)，自由飲水和進(jìn)食，并給予抗生素及補(bǔ)液治療。

1.3.2 切片制備 各組大鼠按照時間點(diǎn)取出大腦至培養(yǎng)皿中，切取視交叉前后各2 mm 厚的腦組織，放入4% 多聚甲醛磷酸鹽緩沖溶液(pH=7.4)中固定24 h 后，脫水透明，石蠟包埋切片，用于HE 染色及VEGF 免疫組化染色。

1.3.3 TTC 染色 處死大鼠取出腦組織放入-20 ℃冰箱，待組織凍硬后進(jìn)行冠狀切片(片厚2 mm)。將切片放入2%的2，3，5-三苯基氯化四氮唑(2，3，5-triphenyltetrazolium chloride，TTC)溶液中，37℃避光染色30 min。用4%多聚甲醛固定24 h 后拍照，正常腦組織染色后呈鮮紅色，而梗死區(qū)呈蒼白色。在腦的同一部位比較各組之間梗死體積的大小，以反映腦梗死后損傷的程度。

1.3.4 VEGF 免疫組化染色方法 按照VEGF免疫組織化學(xué)染色試劑盒說明書進(jìn)行，光鏡觀察并應(yīng)用HPIAS-2000 顯微圖像處理系統(tǒng)采集圖片，每張切片隨機(jī)取8～10 個200×視野，計數(shù)VEGF 陽性細(xì)胞數(shù)，求其平均值為該張切片VEGF 陽性細(xì)胞數(shù)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法分析 使用SPSS13.0 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，數(shù)值變量資料的分析采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間兩兩比較采用最小顯著差(LSD)t 檢驗(yàn)，檢驗(yàn)水平α=0.05，P＜0.05 表示有統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果

2.1 TTC 染色 TTC 是一種水溶性鹽類物質(zhì)，它能與有活性的線粒體脫氫酶反應(yīng)生成深紅色脂溶性物質(zhì)，在死亡細(xì)胞內(nèi)由于線粒體脫氫酶失活所以與TTC不反應(yīng)和顯色，故正常組織被染成均勻的桔紅色，而梗死灶呈白色，二者界限清晰可見。假手術(shù)組TTC 染色呈均勻桔紅色，無缺血灶。缺血再灌注組腦組織TTC染色都出現(xiàn)大面積的白色區(qū)，腦梗死灶明顯。腺苷預(yù)處理組白色區(qū)域較缺血再灌注組明顯縮小(見圖1)。

2.2 VEGF 蛋白表達(dá)情況 假手術(shù)組:大鼠腦組織脈絡(luò)叢可見少量VEGF 陽性表達(dá)細(xì)胞，其余腦組織偶見VEGF 陽性表達(dá)，各亞組之間未見明顯差異(見圖2);隨著腦組織缺血時間延長，缺血再灌注組和腺苷預(yù)處理組VEGF 陽性表達(dá)呈現(xiàn)逐漸增高后又逐漸降低的變化，2 h 開始增高，6 h 繼續(xù)增高，24 h 達(dá)到高峰，72 h 略有下降，但處于較高水平;缺血再灌注組:在大鼠的大腦皮層、紋狀體等部位的神經(jīng)元及神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞陽性表達(dá)明顯，以缺血梗死灶周邊區(qū)表達(dá)最明顯(見圖3～圖6);腺苷預(yù)處理組:腺苷預(yù)處理各亞組較缺血再灌注各亞組陽性表達(dá)形態(tài)及部位均相似，陽性表達(dá)較缺血再灌注組增高(見圖7～圖10)。各組大鼠腦組織VEGF 陽性表達(dá)強(qiáng)度不同，F(xiàn) 組各亞組中VEGF 陽性表達(dá)無明顯差別。IR 組及AP 組VEGF 陽性表達(dá)從2 h 開始逐漸增強(qiáng)，到24 h 達(dá)到高峰，72 h 時均有所減弱。2 h 時IR組和AP 組積分光密度值無明顯差別(P＞0.05)。6 h、24 h 及72 h 時AP 組各亞組與IR 組各相應(yīng)亞組比較明顯增高(P＜0.05)(見表1)。

表1 各組別不同時間點(diǎn)VEGF 表達(dá)的平均積分光密度(±s)

表1 各組別不同時間點(diǎn)VEGF 表達(dá)的平均積分光密度(±s)

注:與F 組比較* P＞0.05，△P ﹤0.05;與IR 組比較#P＞0.05，▽P ﹤0.05

圖1 不同組別TTC 染色結(jié)果

3 討論

腦血管病是當(dāng)今社會發(fā)病率、死亡率極高的一種疾病，其發(fā)病率在我國有明顯增加的趨勢且已成為死因構(gòu)成的重要原因之一。缺血性腦血管病是腦血管病中較為常見的一類，極大地危害著人們的身體健康，而腦缺血同時也是多種腦損傷疾病共同的病理生理基礎(chǔ)，如何減輕腦缺血后的神經(jīng)損傷、提高腦組織對缺血的耐受，一直是臨床研究的重點(diǎn)和難點(diǎn)，也是臨床預(yù)防和治療缺血性腦血管疾病的發(fā)展方向。短暫性腦缺血發(fā)作，即缺血預(yù)處理(ischemia preconditioning，IPC)對腦細(xì)胞有保護(hù)作用，可以減輕缺血組織的病變程度，誘導(dǎo)腦缺血耐受(ischemia tolerance，IT)，可抵抗以后嚴(yán)重的腦缺血。1999 年國外對141 例有或無TIA 史的卒中患者進(jìn)行回顧性病例對照研究，結(jié)論支持TIA 誘導(dǎo)腦缺血耐受。已有的研究結(jié)果表明，缺血耐受是迄今已知的最強(qiáng)的內(nèi)源性保護(hù)機(jī)制，是機(jī)體抵抗缺血再灌注(ischemia-reperfusion，IR)損傷的一種生物現(xiàn)象［1］。腦缺血耐受的提出為防止腦缺血再灌注損傷開拓了新的研究領(lǐng)域，缺血預(yù)處理對大腦的保護(hù)作用、對研究內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)機(jī)制和神經(jīng)保護(hù)治療方法提供了新的研究方向。然而在實(shí)際的臨床工作中在患者發(fā)生腦損傷之前對大腦進(jìn)行短暫的缺血預(yù)處理是不現(xiàn)實(shí)的，因此臨床工作中預(yù)處理更多應(yīng)該選擇藥物來實(shí)現(xiàn)。藥物預(yù)處理安全、方便、易于控制劑量，用藥物替代IPC 進(jìn)行預(yù)處理以達(dá)到神經(jīng)保護(hù)的目的，可能將在臨床預(yù)防和治療缺血性腦血管病、腦損傷、器官移植等方面發(fā)揮重要作用。本實(shí)驗(yàn)中選擇腺苷作為治療腦缺血再灌注損傷預(yù)處理的藥物。腦缺血缺氧時引起腺苷(腺嘌呤核苷)釋放，腺苷作為一種神經(jīng)遞質(zhì)與G 蛋白偶聯(lián)受體(主要是受體A1)結(jié)合后，激活A(yù)TP 依賴的鉀離子通道，抑制興奮性氨基酸釋放，阻止興奮性氨基酸誘導(dǎo)的神經(jīng)元除極效應(yīng)，降低細(xì)胞膜對鈣離子的通透性，擴(kuò)張血管，抑制炎性細(xì)胞黏附和浸潤，抑制血小板聚集，減輕炎性細(xì)胞、自由基導(dǎo)致的血管內(nèi)皮損傷［2］。腺苷是一種內(nèi)源性神經(jīng)保護(hù)劑，其發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用主要是通過A1 受體阻滯Ca2+內(nèi)流，抑制谷氨酸和天門冬氨酸的釋放。Heurteaux 等［3］發(fā)現(xiàn)應(yīng)用A1 受體拮抗劑可以完全阻斷缺血預(yù)處理的保護(hù)作用。近年來國內(nèi)外少有腺苷預(yù)處理對腦缺血的報道，本課題組應(yīng)用腺苷預(yù)防治療腦缺血再灌注損傷亦獲得了良好的效果。

近年來，研究表明，受損的腦可出現(xiàn)神奇的再塑性，神經(jīng)元發(fā)生的機(jī)制均與血管再通有重要的相關(guān)性，所以血管生成可以為大腦修復(fù)提供新的思路［4，5］。腦缺血再灌注損傷后，提高神經(jīng)系統(tǒng)的血管再生可以促進(jìn)損傷神經(jīng)元的回訪，減輕腦缺血的后遺癥，改善腦缺血后康復(fù)的臨床效果。促進(jìn)血管生成機(jī)制可能涉及多個因素，主要包括生長因子、粘附分子和神經(jīng)干細(xì)胞等。許多生長因子可能參與了血管生成，最具有代表性的是血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)。VEGF 是一種高度特異的血管內(nèi)皮細(xì)胞有絲分裂素，具有誘導(dǎo)血管生成的功能，VEGF 還可間接地促進(jìn)神經(jīng)再生、學(xué)習(xí)、記憶并抑制細(xì)胞凋亡［6，7］。目前己經(jīng)證實(shí)，缺血及移植損傷能顯著上調(diào)神經(jīng)元及星狀細(xì)胞VEGF 的表達(dá)［8］，這與我們在實(shí)驗(yàn)中觀察到的VEGF 表達(dá)部位是一致的。在缺血區(qū)域的神經(jīng)元、膠質(zhì)細(xì)胞、與中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥反應(yīng)有關(guān)的細(xì)胞包括反應(yīng)性星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞VEGF 的表達(dá)均明顯增加，提示其可能參與中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)。因此，對中樞及外周神經(jīng)系統(tǒng)的創(chuàng)傷有可能在一定程度上觸發(fā)由VEGF 介導(dǎo)的細(xì)胞發(fā)育事件，通過正常的血管灌流來調(diào)節(jié)生理功能以滿足代謝要求。最近有報道在脊髓挫傷模型中單次應(yīng)用一定劑量的VEGF，能明顯促進(jìn)行為學(xué)功能恢復(fù)［9］，且與VEGF 受體表達(dá)增高密切相關(guān)，主要表現(xiàn)為組織凋亡減少、血管密度增加。這說明VEGF 既有的血管形成作用，又有潛在的神經(jīng)營養(yǎng)作用。

本實(shí)驗(yàn)用腺苷進(jìn)行預(yù)處理后制備大腦中動脈腦缺血模型，再灌注后選擇不同時間點(diǎn)通過TTC 染色觀察腦梗死體積和運(yùn)用免疫組織化學(xué)法檢測血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)的表達(dá)，探討腺苷預(yù)處理在腦缺血再灌注損傷中可能的保護(hù)機(jī)制，為臨床應(yīng)用腺苷預(yù)防和治療缺血性腦血管疾病提供理論依據(jù)，同時為減輕腦梗死損傷提供一條治療思路。

圖2 F 組VEGF 的表達(dá)(×200)

圖3 IR 組2 h VEGF 的表達(dá)(×200)

圖4 IR 組6 h VEGF 的表達(dá)(×200)

圖5 IR 組24 h VEGF 的表達(dá)(×200)

圖6 IR 組72 h VEGF 的表達(dá)(×200)

圖7 AP 組2 h VEGF 的表達(dá)(×200)

圖8 AP 組6 h VEGF 的表達(dá)(×200)

圖9 AP 組24 h VEGF 的表達(dá)(×200)

圖10 AP 組72 h VEGF 的表達(dá)(×200)

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