紅皮云杉球果原花青素提取優化及抗氧化活性評價

鄭洪亮，何 飛，騰 飛，王 萍，王振宇，2，*，馬思慧

（1.東北林業大學林學院，黑龍江哈爾濱150040；2.哈爾濱工業大學食品科學與工程學院，黑龍江哈爾濱150086）

近年來，人們對自身健康越來越關注，掀起了天然產物開發熱潮。尤其是具有強抗氧化活性的植物源原花青素，來源豐富，廣泛分布于植物界，有多樣的生理功效。據有關文獻記載，葡萄籽中提取的原花青素具有抗腫瘤、抗氧化、抗動脈硬化、防治冠心病與中風等心腦血管疾病以及抗菌等作用[1]。以蘋果、茶、葡萄、柑橘等為原料已經成功開發出原花青素[2]，原花青素的獨特化學結構與其獨特化學性質密切相關，在食品、醫藥、化妝品等許多行業已經開發利用[3]。

紅皮云杉是常綠喬木，松科云杉屬，學名Picea koraiensis Nakai，在吉林山區海拔1400～1800m地帶、東北小興安嶺地區分布比較豐富，球果呈卵狀圓柱形或圓柱狀矩圓形，是我國重要的生物資源。近年來，對松科植物原花青素的提取國內外研究不多。Duncan[4]以松樹皮為原料，在脫氧熱水中浸提（1min～20h）得到原花青素粗提物；黃啟亮等[5]以松針為原料提取原花青素，并對其主要生物活性進行研究；李童等[6]以云南思茅松樹皮為原料，研究思茅松原花青素的降度提取工藝。秦永劍等[7-8]研究了云南松多聚原花青素降解產物抗氧化活性和低聚原花青素抗氧化活性。

本研究考察了溫度、料液比、溶劑濃度和提取時間對原花青素得率的影響，再通過響應曲面實驗，確定提取最優條件。利用D4020大孔樹脂對紅皮云杉原花青素粗提物進行純化，然后對紅皮云杉原花青素精制物進行抗氧化活性評價實驗，較系統的分析了原花青素的提取優化工藝及抗氧化能力。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

紅皮云杉球果 黑龍江省葦河林業局提供，采集時間為2011年9月，將球果鱗片（去掉中間木質軸）低溫干燥后粉碎過80目篩后-20℃密封冷凍，備用；1，1-二苯基苦基苯肼（DPPH）、ABTS、5，6-聯苯基-3-（2-吡啶基）-1，2，4-三吖嗪（Ferrozine）、維生素E 美國Sigma公司；兒茶素 色譜級，上海源葉公司；FRAP試劑盒 碧云天試劑公司；抗壞血酸、濃硫酸、甲醇、硫酸亞鐵、30%過氧化氫、三氯乙酸（TCA）、濃鹽酸、磷酸二氫鈉、磷酸氫二鈉、檸檬酸、硫酸亞鐵、氯化亞鐵、無水乙醇 國產分析純；蒸餾水。

RT-6000酶標儀 深圳雷社生命科技股份有限公司；TDL-5臺式離心機 上海科興儀器有限公司；T6紫外可見分光光度計 北京普析通用公司；旋轉R-205B蒸發儀 上海申勝儀器公司；NDJ-1電熱恒溫水浴鍋 北京醫療電子儀器廠；FJ-200高速萬能粉碎機 天津泰斯特儀器公司；DHG-9240電熱恒溫鼓風干燥箱 上海一恒科技有限公司；YP200lN電子天平 上海精天電子儀器廠；XW-80A漩渦混合器 江蘇海門市其林貝爾儀器制造有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 兒茶素標準曲線的建立 采用香草醛-硫酸法[9]。

配制兒茶素不同濃度標準溶液：0.03、0.06、0.09、0.12、0.15、0.18、0.21、0.24、0.27、0.30mg/mL。精確移取1.0mL分別置于10支10mL相同規格試管中，然后分別加入2.5mL、4%香草醛-甲醇溶液和2.5mL、30%濃硫酸-甲醇溶液，混合均勻，于30℃水浴中避光靜置15min，以甲醇代替顯色劑為空白對照，在500nm波長下測定溶液吸光值，平行測樣三次。以標準溶液濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，建立標準曲線并擬合回歸方程。根據方程計算提取物中花青素濃度，然后根據樣品質量進一步換算成得率。

1.2.2 紅皮云杉球果原花青素提取優化實驗

1.2.2.1 單因素實驗設計

a.乙醇濃度對提取效果的影響：固定提取時間4h，料液比1∶20（g/mL），提取溫度為60℃，分別以乙醇濃度0%、20%、40%、60%、80%、100%提取，并計算原花青素得率。

b.提取溫度對提取效果的影響：固定提取時間4h，乙醇體積分數為60%，料液比1∶20（g/mL），分別以提取溫度30、40、50、60、70、80℃提取，并計算原花青素得率。

c.料液比對提取效果的影響：固定提取時間4h，提取溫度50℃，乙醇體積分數60%，分別以料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60（g/mL）提取，并計算原花青素得率。

d.提取時間對提取效果的影響：固定提取溫度50℃，料液比1∶40（g/mL），乙醇體積分數為60%，分別以提取時間1、2、3、4、5、6h提取，并計算原花青素得率。

1.2.2.2 響應面實驗設計 在單因素實驗基礎上，以料液比（X1）、提取時間（X2）、提取溫度（X3）、乙醇濃度（X4）4個因素為自變量，以原花青素得率為響應值，設計四因素三水平的響應曲面實驗見表1，原花青素得率公式如下。

式中，ω為原花青素得率（mg/g）；C為原花青素的質量濃度（mg/mL）；V為提取液體積（mL）；N為稀釋倍數；M為樣品質量（g）。

表1 紅皮云杉球果原花青素提取響應面實驗因素水平及編碼Table 1 Coded values and corresponding actual values of factors in BBD design

1.2.3 紅皮云杉球果原花青素粗提物的純化[10]原花青素提取物2.5mg/mL，作為上樣液。在處理好的D4020型大孔吸附樹脂柱加入上樣液，徑高比1∶25，以2.0BV/h的流速上樣，吸附4h，將大孔樹脂柱用蒸餾水洗至流出液呈無色后，用70%、4BV的乙醇對大孔樹脂吸附柱洗脫，洗脫流速1.5BV/h，將70%乙醇洗脫液收集，減壓濃縮至無醇味后，備用。

1.2.4 原花青素的抗氧化能力評價

1.2.4.1 DPPH·清除作用 紅皮云杉球果原花青素提取物精制后，配制成濃度為10、20、30、40、50、60、70、80、90μg/mL的溶液。分別在10.0mL試管中加入2.0mL上述不同濃度樣品溶液，之后加入2.0mL 1×10-3mol/L DPPH·溶液（用95%乙醇配制），混合均勻，暗處反應30min，在517nm處測定其吸光值，用2.0mL無水乙醇替代2.0mL樣品液作參比，測定吸光值A，同時以乙醇溶液為參比測定DPPH空白溶液吸光度值A0，用Trolox作陽性對照，同時做平行實驗[11]。計算DPPH·清除率RSA：

以清除率RSA對樣品濃度進行回歸處理，計算提取物的半數抑制濃度（IC50）數值。

1.2.4.2 ABTS+·清除作用 在96孔板的樣品檢測孔和對照孔中依次加入45μL不同濃度的樣液；空白對照孔中加入45μL PBS緩沖液；然后檢測孔和空白孔中依次加入300μL ABTS+·自由基工作液，對照空中加入等量的PBS緩沖液，避光反應6min，于734nm波長下測吸光值[12]。

其中：A1為加測定溶液后ABTS+·的吸光值；A2為測定溶液在測定波長下的吸光值；A3為未加測定溶液時ABTS+·的吸光值。

1.2.4.3 總抗氧化能力的測定 采用FRAP法[13]。

a.FeSO4標準曲線的準備：稱取27.8mg FRAP試劑盒提供的FeSO4·7H2O，溶解并定容到1mL，此時濃度即為100mmol/L。取適量100mmol/L FeSO4溶液稀釋至0、100、200、300、400、500μg/L。可以使用蒸餾水或樣品配制溶液配制標準品。FeSO4溶液宜新鮮配制使用。

b.總抗氧化能力的測定：96孔板的檢測孔中加入180μL FRAP工作液（現用現配）。空白對照孔中加入40μL蒸餾水；樣品檢測孔內加入40μL各種濃度的樣品或Trolox作為陽性對照，輕輕混勻。37℃孵育3～ 5min后測定A593。根據標準曲線計算出樣品的總抗氧化能力[13]。

2 結果與分析

2.1 原花青素含量標準曲線的繪制

原花青素質量濃度與吸光度曲線的回歸方程如圖1所示。回歸方程y＝2.1658x+0.0178，R2≈0.9995，式中：y—溶液在500nm處的吸光度；x—溶液中的原花青素質量濃度（mg/mL）。

圖1 兒茶素標準曲線Fig.1 Catechin standard curve

2.2 紅皮云杉球果原花青素提取單因素實驗

2.2.1 乙醇濃度對提取效果的影響 乙醇濃度對原花青素提取效果的影響如圖2所示。

圖2 乙醇濃度對原花青素提取得率的影響Fig.2 Effect of different ethanol concentrations on extraction rate

濃度小于60%時，隨著乙醇濃度增大，溶劑中原花青素含量也增加；大于60%時，隨著乙醇濃度增大，溶劑中原花青素含量有所降低，可能是由于乙醇濃度繼續增加會加大醇溶性雜質、色素、親脂性等成分的溶出，這些成分與原花青素競爭，同乙醇水分子結合，同時組織的通透性下降，從而導致原花青素的溶解度下降[14]，因此乙醇濃度選為60%。

2.2.2 提取溫度對提取效果的影響 溫度對原花青素提取效果的影響如圖3所示。

圖3 提取溫度對原花青素提取得率的影響Fig.3 Effect of different temperature on extraction rate

溫度升高，分子熱運動加快，有利于傳質過程的進行。小于50℃時，隨著溫度增加，紅皮云杉原花青素大量溶出，從而溶劑中其含量增加；溫度超過50℃而小于70℃時，原花青素的含量開始下降，是由于溫度升高導致原花青素開始降解，其結構發生變化[15]；當溫度超過70℃時，原花青素溶解量又開始略有增加，是因為可能與較高溫度下，其他雜質物質大量溶出有關[16]，故50℃為原花青素最佳提取溫度。

2.2.3 料液比對提取效果的影響 料液比對原花青素提取效果的影響圖4所示。

由圖4可知料液比對得率影響較大。當料液比大于1∶10（g/mL）時，隨著料液比增加，原花青素得率明顯增加，這是因為有機溶劑能抑制原花青素與植物中的蛋白、多糖等物質結合，增加料液比有利于原花青素更大限度的浸出[17]，但料液比繼續增大又會增加原花青素與空氣接觸的機會，而原花青素容易氧化降解，所以得率有所降低，同時料液比增加還會造成原料的浪費[18]，因此選擇料液比為1∶40（g/mL）。

2.2.4 提取時間對提取效果的影響 提取時間對原花青素提取效果的影響如圖5所示。

在提取時間低于2h時，原花青素濃度隨時間增長而增大，溶劑中原花青素濃度低，紅皮云杉球果粉末原花青素含量高，兩個體系有高濃度差，傳質動力大，原花青素浸出速率快[19]。2h后，原花青素濃度隨時間變化的得率減小，是由于隨著時間的進一步延長，可能是由于原花青素對熱敏感，時間過長會造成其被氧化變性，考慮到縮短工藝時間，提高效率，最佳提取時間為2h。

2.3 紅皮云杉球果原花青素提取響應面優化實驗

表2 響應面分析及結果Table 2 Experiment design and results of response surface method

2.3.1 響應曲面法實驗設計及結果 在單因素實驗基礎上，設計了乙醇濃度、溫度、時間、料液比的4因素3水平響應面法實驗設計，其因素水平見表1，所得實驗結果見表2。

選用中心復合模型，做四因素三水平共29個實驗點（5個中心點）的響應面分析實驗。這29個實驗點分為兩類：其一是析因點，自變量取值在各因素所構成的三維頂點，共有24個析因點；其二是零點，為區域的中心點，零點實驗重復5次，用以估計實驗誤差。紅皮云杉球果原花青素提取率為響應值（指標值）。使用響應曲面法分析軟件對表2中原花青素得率大小的數據進行處理，分析后得出的回歸方程為：y= 142.63+1.65A+2.55B-3.53C+8.79D+0.49AB+1.50AC+ 1.07AD+1.33BC+1.12BD+2.86CD-24.14A2-16.14B2-16.90C2-10.95D2。

采用響應面法軟件對實驗結果進行方差分析，其結果見表3。

模型誤差p＜0.0001，顯著；失擬項p=0.2120＞0.05，差異不顯著，說明了方程對實驗擬合的情況好，實驗誤差小；變異系數值為3.47，說明了實驗可靠；模型的校正系數R2adj=0.9366，說明該模型能解釋93.66%響應值的變化，僅有總變異大約6%不能用此模型來解釋。

時間、料液比的一次項，乙醇濃度、溫度、時間、料液比的二次項對得率的影響極顯著；溫度的一次項影響為顯著；乙醇濃度及4因子的交互的影響不顯著。通過F值還能看出，實驗中各因素對原花青素得率的影響大小順序為：料液比＜時間＜溫度＜乙醇濃度。此回歸模型得出BBD實驗的最優提取條件為：乙醇濃度為60.42%，溫度50.91℃、時間1.97h、料液比為1∶44（g/mL），此時原花青素得率為72.46mg/g。

2.3.2 響應面結果驗證實驗 為檢驗響應面法優化紅皮云杉球果原花青素提取工藝的可靠性，采用優化后提取工藝條件進行驗證實驗，參考實際操作，將優化后工藝參數調整為：乙醇濃度為60%，溫度51℃、時間2h、料液比為1∶44（g/mL），在此最佳條件下，提取紅皮云杉球果原花青素得率為（71.23±0.25）mg/g，與模型預測值的比較誤差為1.70%。

2.4 紅皮云杉球果原花青素精制物的制備

紅皮云杉球果原花青素經D4020的純化，純化前原花青素純度為29.45%±1.33%，純化后純度為68.57% ±1.78%，回收率為88.27%±3.18%。

2.5 紅皮云杉球果原花青素精制物的抗氧化評價

2.5.1 紅皮云杉球果原花青素精制物對DPPH·的清除作用 如圖6所示，紅皮云杉球果原花青素精制物對DPPH·自由基具有顯著的清除作用。以Trolox做陽性對照，在90μg/mL時清除率分別為90.7%±2.07%和69.58%±1.56%。紅皮云杉球果原花青素精制物和Trolox在實驗濃度的IC50值分別為（41.04±1.12）μg/mL、（16.62±0.98）μg/mL。從總體上看，紅皮云杉球果原花青素精制物清除DPPH·自由基能力較強，但低于Trolox。

2.5.2 紅皮云杉球果原花青素精制物對ABTS+·的清除作用 如圖7所示，不同濃度紅皮云杉球果原花青素精制物對ABTS+·自由基均具有很顯著的清除作用。以Trolox做陽性對照，在相同濃度條件下，陽性對照Trolox的清除率均超過紅皮云杉球果原花青素精制物。紅皮云杉球果原花青素精制物和Trolox在實驗濃度的IC50值分別為（20.45±1.08）μg/mL、（32.94± 0.65）μg/mL。從總體上看，紅皮云杉球果原花青素精制物具有很強的清除ABTS+·自由基能力，接近于陽性對照Trolox。

2.5.3 紅皮云杉球果原花青素精制物的還原能力（FRAP） 用FeSO4做標準品，標準曲線為y=0.123x-0.007，R2=0.9982。

表3 回歸模型方差分析表Table 3 ANOVA for Response Surface Quadratic Model

圖6 紅皮云杉球果原花青素對DPPH·清除作用Fig.6 DPPH radical scavenging activity of proanthocyanidins from Picea koraiensis Nakai’s cones

圖7 紅皮云杉球果原花青素對ABTS+·清除作用Fig.7 ABTS radical scavenging activity of proanthocyanidins from Picea koraiensis Nakai’s cones

圖8 FeSO4標準曲線Fig.8 FeSO4standard curve

研究表明，植物提取物的抗氧化能力與還原能力之間具有很好的相關性，還原能力可以作為一種衡量抗氧化能力的指標[20]。具有還原能力的物質可以通過提供氫質子將體系中鐵離子還原，從而抑制自由基的產生[21]。由圖9可以看出，紅皮云杉球果原花青素、Trolox的還原能力與濃度之間呈現出顯著的相關性，相關系數R2分別為：0.9959、0.9907。紅皮云杉球果原花青素還原能力略高于Trolox。紅皮云杉球果原花青素、Trolox還原力的半效濃度值（EC50值）依次為（34.95±0.55）、（39.31±0.98）μg/mL。

圖9 紅皮云杉球果原花青素精制物的還原能力Fig.9 Reducing power of proanthocyanidins from Picea koraiensis Nakai’s cones

3 結論

本實驗通過對紅皮云杉球果原花青素的提取工藝研究，獲得最佳條件為：乙醇濃度為60%、溫度51℃、時間2h、料液比為1∶44（g/mL），此時原花青素得率為（71.23±0.25）mg/g。紅皮云杉球果原花青素精制物的體外抗氧化活性研究結果表明紅皮云杉球果原花青素精制物具有較強的清除自由基能力和還原能力，并且在實驗濃度范圍時，清除ABTS+·能力和還原能力高于陽性對照Trolox。這說明紅皮云杉球果原花青素具有較強的抗氧化能力，有待進一步進行深入研究。

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