響應面法優化藍刺頭多糖除蛋白工藝的研究

楊 斌，楊 英，王雪飛，胡彥卿，范琳琳，劉丹丹，朱 浩

（內蒙古農業大學獸醫學院，內蒙古呼和浩特010018）

藍刺頭（Echinops latifolius Tausch）為菊科藍刺頭屬植物。其根和頭狀花序入藥，味苦、性寒、歸胃經，具有清熱解毒、排膿止血、消癰下乳、接骨療傷的功效，用于治療諸瘡癰腫、乳汁不通、骨折等癥[1]。現代研究發現，藍刺頭具有抗腫瘤、抗炎、抗菌、抗病毒、殺蟲、保肝等功效[2-5]，藍刺頭多糖是其主要活性成分之一。近年來，多糖所具有的各種生理功能逐漸被人們所重視，如降低血糖濃度、抗腫瘤、抗疲勞及抗衰老等。從天然動植物提取的多糖，往往含有大量蛋白質，蛋白質的存在不僅可能影響其結構和生物活性，且可能導致藥理作用下降，因此，脫蛋白是一個重要的環節。常見的脫蛋白方法有三氯乙酸法、Sevage法、木瓜蛋白酶法等[6]，不同的除蛋白方法適用于不同來源的多糖，目前尚未見到去除藍刺頭多糖中蛋白質方法的研究報道。本實驗通過對以上3種方法的比較，對藍刺頭多糖中蛋白質最佳去除方法進行了探討，以清潔、條件溫和、操作簡單的方法為多糖類藥品和保健產品的開發提供了有利條件。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

藍刺頭 采摘自內蒙古鄂爾多斯市，植物鑒定由內蒙古農業大學中獸醫教研室完成；木瓜蛋白酶，牛血清白蛋白 Sigma；考馬斯藍G-250（Amresco），葡萄糖、三氯乙酸、三氯甲烷、苯酚、正丁醇、濃硫酸等 均為分析純。

Synergy H4型全功能酶標儀 美國伯騰儀器有限公司；KQ-500VDB型數控超聲波清洗器 昆山超聲儀器有限公司；RE-52CS型旋轉蒸發儀 上海亞榮生化儀器廠；循環水式多用真空泵 鄭州長城科工貿有限公司；數顯恒溫水浴鍋 常州國華電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 多糖的提取工藝流程 藍刺頭用蒸餾水洗凈，置于70℃烘箱烘干，粉碎，過40目篩，加30倍蒸餾水超聲提取20min，超聲功率為360W，溫度為30℃，藥液過濾，3000r/min離心10min，取上清液，得多糖溶液。

1.2.2 多糖含量的測定 以葡萄糖為標準曲線，采用苯酚-硫酸法進行測定[7]。多糖保留率（%）=脫蛋白后多糖的含量/脫蛋白前多糖的含量×100。

1.2.3 蛋白質含量的測定 蛋白質含量的測定采用考馬斯亮藍法進行[8]測定。蛋白去除率（%）=（脫蛋白前蛋白的含量-脫蛋白后蛋白的含量）/脫蛋白前蛋白的含量×100。

1.3 脫蛋白方法

1.3.1 TCA法[9]首先于每只具塞試管中加入5mL多糖提取液，再分別加入1、2、3、4、5mL 3mol·L-1的三氯乙酸溶液，混勻后4℃靜置過夜，離心棄去沉淀，測定上清液中蛋白和多糖的濃度。

1.3.2 Sevage法[10]取50mL多糖提取液，按照多糖提取液、氯仿、正丁醇的體積比為16∶4∶1加入氯仿與正丁醇，溶液劇烈振蕩30min后靜置，待液體分層后分離出上清液，重復多次上述步驟，每次測定上清液中蛋白和多糖濃度。

1.3.2.1 木瓜蛋白酶法[11]取10mL多糖提取液，加入0.2mL木瓜蛋白酶液（10g/L），溫度為60℃，酶解2.5h，反應結束后沸水浴10min，冷卻至室溫，3000r/min離心10min除去沉淀，測定上清液中蛋白和多糖濃度。

1.3.3 木瓜蛋白酶法除蛋白單因素實驗[11]

1.3.3.1 酶解溫度對蛋白去除率的影響 分別取10mL多糖提取液，加入0.2mL木瓜蛋白酶液（10g/L），調節pH為5.0，酶解時間為1.5h，酶解溫度分別為50、55、60、65、70℃，反應結束后沸水浴10min，冷卻至室溫，3000r/min離心10min除去沉淀，測定上清液中蛋白濃度。

1.3.3.2 酶解時間對蛋白去除率的影響 分別取10mL多糖提取液，加入0.2mL木瓜蛋白酶液（10g/L），調節pH為5.0，酶解溫度為60℃，酶解時間分別為0.5、1.0、1.5、2.0、2.5h，反應結束后沸水浴10min，冷卻至室溫，3000r/min離心10min除去沉淀，測定上清液中蛋白濃度。

1.3.3.3 酶解pH對蛋白去除率的影響 分別取10mL多糖提取液，加入0.2mL木瓜蛋白酶液，調節pH分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0，60℃水浴酶解2h，反應結束后沸水浴10min，冷卻至室溫，3000r/min離心10min除去沉淀，測定上清液中蛋白濃度。

1.3.4 酶解的響應面優化方案 在單因素實驗的基礎上，根據Box-Behnken中心組合設計原理，選擇A（溫度）、B（時間）、C（pH）為影響因素，設計三因素三水平的響應面分析方案（見表1），進行除蛋白工藝參數的優化。

表1 響應面因素與水平Table 1 Factors and levels of response surface analysis

2 結果與分析

2.1 TCA法除蛋白結果

TCA是酸性物質，能使蛋白質帶正電荷，并與負離子結合成不溶性的鹽類。TCA法除蛋白結果見圖1。由圖1可知，蛋白清除率隨著TCA加入量的增加，從45.13%增加到48.76%，同時多糖結構的破壞程度也相應的增加，導致多糖的損失逐漸增大，多糖保留率從61.05%減少到37.38%。

圖1 TCA法脫蛋白效果Fig.1 The effect of removal with the TCA

2.2 Sevage法除蛋白結果

Sevage法是利用有機溶劑能夠使溶液中的蛋白質變性沉淀的性質分離清除蛋白質。Sevage法除蛋白結果見圖2。由圖2可知，隨著脫蛋白次數的增加蛋白清除率也相應的升高，Sevage法脫蛋白3次時蛋白清除率為47.47%，此后隨著脫除次數的增加，蛋白清除率基本保持穩定，而多糖隨脫除次數的增加損失逐步加大，多糖保留率從75.41%減少到58.57%。

圖2 Sevage法脫蛋白效果Fig.2 The effect of removal with the Sevage

2.3 三種脫蛋白方法比較

將三種脫蛋白方法進行綜合比較，由表2可知，酶法蛋白清除率（56.57%）高于TCA法（45.13%）與Sevage法（47.47%），其多糖保留率（98.16%）亦遠遠高于其他兩種方法（TCA法61.05%，Sevage法67.65%），同時三氯乙酸酸性較強，可能引起多糖降解，Sevage法過程操作繁瑣，酶法的反應條件溫和，操作簡便，綜合分析三種除蛋白方法，確定使用酶法對藍刺頭多糖中蛋白質進行脫除，并使用響應面法對其除蛋白工藝進行優化。

表2 三種脫蛋白方法效果比較（±s，n=3）Table 2 The comparison of deproteinization effect of three methods（±s，n=3）

表2 三種脫蛋白方法效果比較（±s，n=3）Table 2 The comparison of deproteinization effect of three methods（±s，n=3）

指標 TCA法 Sevage法 木瓜蛋白酶法蛋白脫除次數 1 3 1蛋白清除率（%） 45.13±0.09 47.47±0.13 56.57±0.12多糖保留率（%） 61.05±0.11 67.65±0.13 98.16±0.06

2.4 酶法除蛋白單因素實驗結果

2.4.1 pH對蛋白去除率的影響 隨著多糖溶液的pH不同，酶對蛋白的清除率也相應的產生變化，由圖3可知，pH為5時蛋白的清除率最大，說明該酶的最適反應pH為5.0左右，所以選擇pH4、5、6作為響應面實驗的中心值。

圖3 pH對蛋白清除率的影響Fig.3 Effect of pH on protein removal efficiency

圖4 酶解時間對蛋白清除率的影響Fig.4 Effect of time on protein removal efficiency

2.4.2 酶解時間對蛋白去除率的影響 由圖4可知，隨著酶解時間的延長蛋白清除率也在逐步增大，但1.5h之后蛋白清除率沒有隨著酶解時間的延長而增大，說明反應的最適時間為1.5h左右，所以選擇時間1、1.5、2h作為響應面實驗的中心值。

2.4.3 酶解溫度對蛋白去除率的影響 由圖5可知，隨著酶解溫度的升高，蛋白的清除率先升高后下降，溫度超過65℃后，蛋白的清除率開始明顯的下降，說明該酶的最適反應溫度在65℃左右，所以選擇溫度60、65、70℃作為響應面實驗的中心值。

2.4.4 響應面結果與分析 響應面優化方案與結果見表3。實驗數據采用Design expert V8.0.6軟件進行多元回歸分析，得出實驗因素對響應值影響的回歸方程為：

表3 響應面分析方案與結果Table 3 Program and experimental results of response surface methodology

對回歸模型進行方差分析可知（表4），該模型回歸顯著（p＜0.0001），失擬項（p=0.0897＞0.05）不顯著，并且該模型決定系數R2=98.53%，表明自變量與響應值之間的模型關系顯著，該模型能夠解釋98.53%響應值的變化，說明回歸方程與實際情況擬合良好，可以用此模型來分析和預測酶法去除藍刺頭多糖中蛋白的結果。F值可以反映出各因素對實驗指標影響的重要性，由F值得到因素貢獻率為：C＞B＞A，即pH＞時間＞溫度，其中pH和時間對方程影響極顯著，溫度的影響為顯著。對模型各項進行方差分析可知，模型中一次項A（溫度）對蛋白清除率的影響為顯著（p＜0.05），一次項B（時間）、C（pH），交互項AB、AC、BC、A2、B2、C2各項對蛋白清除率的影響均為極顯著（p＜0.01）。

表4 回歸模型的方差分析結果Table 4 Variance analysis of mathematical regression model

圖6 溫度與時間對蛋白脫除率的影響Fig.6 Effect of temperature and time on protein removal efficiency

三個因素交互作用對蛋白清除率影響的響應曲面的分析結果見圖6～圖8。其中等高線的形狀可直觀的反映出交互效應的強弱，圓形表示二因素交互作用不顯著，橢圓形表示兩因素交互作用顯著。圖6表示pH為0水平，即pH為5時，反應時間和溫度對蛋白清除率的影響。由圖6可知，當固定溫度不變時，隨著反應時間的延長，蛋白清除率逐步增加，反應2h左右蛋白清除率達到比較平穩的階段，變化不再明顯。當固定時間不變的情況下，蛋白清除率呈現先增大后減小的趨勢。兩者之間的影響可以通過等高線看出。等高線呈橢圓，說明兩者相互作用對蛋白脫除率的影響顯著，且時間在2h、溫度在65℃左右蛋白清除率有最大值。

圖7表示當固定酶解時間在0水平，即時間為1.5h，反應體系的pH和溫度對蛋白清除率的影響。由圖7可以看出，當固定pH不變的情況下，隨著溫度的升高蛋白清楚率逐漸增大，65℃左右達到最大值后趨向平穩。當固定溫度不變時，隨著pH的增加，蛋白清除率先增大后減小，在5.5左右達到最大值。由等高線可以看出pH和溫度交互作用對蛋白清除率的影響顯著，蛋白清除率的最大值出現在pH5.5溫度65℃左右。

圖7 溫度與pH對蛋白脫除率的影響Fig.7 Effect of temperature and pH on protein removal efficiency

圖8表示當固定反應的溫度在0水平，即溫度65℃，反應的pH和時間對蛋白清除率的影響。由圖8可知，當固定反應的pH不變的情況下，隨著反應時間的增加，蛋白清除率逐漸增大，2h左右達到最大值，之后曲面趨向平緩。當固定反應時間不變時，隨著pH的增大，在5.5左右蛋白清除率達到最大值，之后趨向平緩。由等高線可知，pH和時間兩因素的交互作用對蛋白清除率的影響顯著，蛋白清除率的最大值出現在pH5.5、時間2h左右。

圖8 時間與pH對蛋白清除率的影響Fig.8 Effect of time and pH on protein removal efficiency

通過數據分析得到藍刺頭多糖除蛋白的最佳工藝參數為溫度63.69℃，時間2.64h，pH5.84，得出最大蛋白清除率為56.82%，多糖保留率為98.12%，效果良好。

2.5 最佳工藝驗證

實際應用中對酶法除蛋白的最佳工藝參數進行適當的調整，之后對同一批多糖提取液進行驗證實驗（n=3），蛋白去除率為56.57%±0.03%，接近于理論去除率56.82%，說明該提取工藝是可操作性強，結果穩定可靠。

表5 驗證實驗結果Table 5 Result of process verification

3 結論與討論

Sevage法除蛋白過程復雜，需要多次重復，雖然三氯乙酸法操作相對簡單，但這兩種方法的的多糖損失率均較高，同時在反應過程中使用了大量的有機試劑，勢必會造成有機物的殘留。木瓜蛋白酶法與TCA法和Sevage法比較其反應條件溫和，且不引入有機試劑，蛋白清除率和多糖保留率均較高，因而能夠較好應用于后續科研及實際生產中。本實驗中根據單因素實驗結果，以反應溫度、時間、pH為因素，蛋白清除率為響應值，利用響應面法對木瓜蛋白酶去除藍刺頭多糖中蛋白質的方法進行優化，結合實際應用情況得到最佳反應條件為溫度：64℃，時間2.6h，pH為6.0，此條件下的蛋白清除率為56.57%，多糖的保留率為98.16%。綜合比較三種方法，木瓜蛋白酶法更適用于藍刺頭多糖中蛋白質的去除，此法條件溫和、操作簡單，為藍刺頭多糖的進一步研究奠定了基礎。

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